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细胞增殖及细胞活力检测方法

 

一、细胞增殖与细胞活性

  细胞增殖是活细胞的重要⽣理功能之⼀,细胞增殖与细胞活性检测所用的方法相近,但实验目的不同。细胞增殖是通过细胞增殖的物质基础判断细胞的数量变化,例如细胞计数法,反应的就是细胞真实的数量。而细胞活性检测,则是通过检测细胞受到药物或其他措施处理后,标志物产量或浓度的变化,进而判断药物或处理措施的作用,细胞活性检测所得结论,往往反映了实验设计的目的。

  细胞增殖检测,因检测标志物的不同,目前大致分为四类:DNA合成检测、代谢活性检测、细胞增殖相关抗原检测和ATP浓度检测。细胞活性检测通常包括细胞膜对核酸染料的通透性、代谢活性、膜电位等的检测,确定细胞的代谢活⼒或细胞代谢产物,通过检测细胞的氧化还原活性反映细胞增殖能⼒。

二、常见细胞增殖检测方法

  1. DNA合成检测——BrdU/ EdU检测法

  细胞在增殖过程中,DNA的倍增,是最显著的变化之一,通过检测DNA量的变化,可判断细胞数量的变化。通过检测DNA进行细胞增殖检测方法,除了同位素标记DNA外,最常用的就是:BrdU / EdU检测法。BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)是胸腺嘧啶(T)的衍生物,可代替胸腺嘧啶在掺入S期的DNA合成,然后利用抗Brdu的单克隆抗体,ICC染色,显示增殖细胞,如果与其它细胞标记物进行双染,则可判断增殖细胞的种类,增殖速度,对研究细胞动力学有重要意义。

  Edu检测法是BrdU的替代方法,也是目前更广泛适用的方法,RrdU需抗体在破开DNA双联后与抗原分子集合后才能显示,这个处理过程对细胞有损伤,而EdU同样可以代替胸腺嘧啶(T)渗入DNA,但其分子大小只有BrdU的1/500,可以直接在DNA双链形态下与染料分子结合用于检测,无需抗体结合反应,实验过程简单,对细胞损伤小,是新一代基于DNA检测时报增殖的试剂。

  1. 代谢活性物质检测——MTT、CCK8

  MTT与CCK8两种方法都是利用检测细胞内线粒体中琥珀酸脱氢酶浓度,进而反映细胞增殖活性。MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)被琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(formazan)并堆积在细胞内,然后以DMSO溶解甲瓒,通过检测甲瓒的吸光度来间接反映存活细胞的相对数量。

  CCK8中的主要物质WST-8是一种类似于MTT的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原生成橙黄色的、水溶性formazan。细胞增殖越多越快,则颜色越深;反之,则颜色越浅。CCK-8的原理跟MTT其实是相同的,不同之处在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的,不需要再吸出培养液加入有机溶剂溶解这个步骤,对细胞毒性小,可进行活细胞动态测定,试剂稳定即开即用,重复性好于MTT。

  1. 细胞增殖相关抗原检测

  Ki-67,PCNA都是细胞增殖因子,在细胞异常增殖中均有显著的表达差异,是研究肿瘤细胞增殖的重要核抗原。Ki-67,PCNA均与细胞周期密切相关,通过免疫反应检测Ki-67,PCNA可反应肿瘤细胞增殖情况。

  1. ATP浓度检测

  细胞内的ATP是细胞能量的重要来源,其含量与细胞周期和细胞状态关系密切,死细胞或濒临死亡的细胞几乎不含ATP。在细胞中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。利用荧光素酶Luciferase及其底物荧光素Luciferin的ATP检测以生物发光为基础,能够为您提供非常灵敏的结果。如果有ATP存在荧光素酶就会发光,而且其发光强度与ATP浓度成正比,这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选。Promega公司开发的CellTiter-Glo Luminescent 实现了”加样-混合-测量”的简单快速检测模式,CellTiter-Glo试剂和细胞培养中的常用培养基兼容,如RPMI 1640, MEM, DMEM, 和Ham’s F12,且不受酚红和有机溶剂的影响,可用于高通量自动化筛选(HTS)。

  1. 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)检测法

  羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是一种可穿透细胞膜的荧光染料,具有与细胞内基质特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团,CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时,CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,子代细胞荧光强度是亲代细胞的一半,在一个增殖的细胞群中,各连续代细胞的荧光强度递减,利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。

三、细胞增殖/活性检测方法比较

常见细胞增殖/活性检测方法比较见下表(含李记生物产品、货号)

检测试剂

试剂盒原理

适用样本

检测设备

生产厂家

EdU/BrdU检测试剂盒(李记新品:AC11L251)

 

检测新新合成DNA,在细胞增殖过程,检测加入到新合成DNA的胸苷类似物(BrdU, EdU)

细胞样本或组织样本

流式细胞术 或
成像分析 或

酶标仪

李记生物

GeneCopoeia

 

CFDA, SE 细胞增殖示踪荧光探针(李记货号:AC11L101)

通过检测亲代和子代细胞中染料CFSE浓度进行细胞增殖次数分析

细胞样本

流式细胞术

李记生物

Thermofisher

Cell Counting Kit(CCK-8 试剂盒)(李记货号:AC11L054)

通过检测细胞内琥珀酸脱氢酶的还原能力,反应细胞活性。检测细胞还原能力荧光信号与代谢中的活细胞数量成正比

细胞样本,HTS

酶标仪

李记生物

日本东仁化学

AlamarBlue细胞活性检测

染料分子在细胞内被还原后释放到胞外,检测荧光,提示细胞代谢变化

细胞样本,HTS

酶标仪

李记生物

Thermofisher

CTG

CellTiter-Glo
(李记研发中)

ATP使荧光素酶发射荧光

细胞样本,HTS

酶标仪

李记生物

Promega