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  免疫印迹又称蛋白质印迹(Western blotting),是通过凝胶电泳(SDS-PAGE)的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测,也可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。

蛋白电泳步骤

Western blot通常作为生物科研新手上路的第一个拦路虎,完整的实验可分为蛋白制备、蛋白定量、蛋白电泳、抗体孵育、转膜封闭、显色成像六大步骤。其中蛋白电泳是十分重要的步骤,是一次成功的Western blot的基础,能直接决定能否得到清晰有效的蛋白条带。在本篇,小李子就稍微简介下传统蛋白电泳的流程:

1、清洗玻璃板:蘸点洗洁精轻轻擦洗,两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

2、 灌胶与上样:

(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧,然后垂直卡在架子上准备灌胶。

(2)按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配置,最后加入TEMED,之后摇匀即可灌胶,然后可以在胶上加一层水,液封后的胶凝的更快。

(3)当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝固,再等几分钟觉得差不多的时候就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

(4)按说明书配积层胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

(5)趁积层胶聚合的这段时间,取适当体积样本混合1X SDS loading buffer,95~100°加热5min,若有沉淀可用稍低温度,比如45~55°加热1h达到变性的目的。

(6)胶做好后连同玻璃板一起安装到电泳槽上,加入电泳缓冲液后加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。

3、电泳:电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺(具体按照各实验室的惯例或者电泳槽的使用说明来操作),电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。

制胶过程常见问题及原因

Q:两块玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平?

A:1、玻璃未洗净;2、温度会影响胶聚合,若受热不均匀,也会影响胶聚合不均;3、加入不均匀,应注意手法;4、灌胶后应进行压胶(可用水或正丁醇);5、过硫酸铵和TEMED加量过多导致凝胶过快而使胶不平;5、加入试剂后未摇匀,导致局部聚合剂浓度过高。

 

Q:Western-blot 制胶时好多泡泡怎么办?

A:1、玻璃板需用洗洁精洗干净后再用双蒸水冲洗、晾干;2、配胶时沿管壁缓缓加入各成分,用手轻轻摇匀,或者用枪头缓慢吹打且不要打到头;3、倒胶时,用枪沿一侧缓缓加入,不要打到底;4、封胶时,可用200ul枪头加水,减小压力;5、室温制胶可能由于温差及凝胶聚合反应放热产生气泡;6、分离胶凝好后,倒掉里面的水,用吸水纸吸干后再加浓缩胶,且迅速插梳子。

注意事项

  实验室传统配胶需要手工一步步操作,非常繁琐且极大增加了实验失误的可能性,除此之外配胶、凝胶、跑胶等步骤都需要非常多的等待时间,在一定程度的拖慢了实验进程。为了更好的服务广大实验客户,李记生物做了几款产品解决蛋白电泳中出现的问题。下面我们简单介绍下各款产品:

  上海李记生物还可提供WB相关全套试剂:RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、蛋白Mark、快速转膜缓冲液、BSA、ECL发光液(增强型、超敏型、飞克级)……

活动内容

1、活动期内购买李记生物产品,均可获赠细胞转染试剂(0.3ml)或Gelred/Gelgreen(50ul)

2、活动期内购买蛋白电泳相关试剂,同一客户第一单可获赠一枚U盘;单次采购每满500,可获赠一个李记生物小风扇或加湿器。

3、转发本文章至朋友圈,集赞98个可获赠一个小米蓝牙项圈耳机

活动编号:Li200706I

活动时间:2020.7.6-2020.9.30

活动范围:全国生物相关终端客户

活动规则:

1、细胞转染试剂0.3ml、Gelred/Gelgreen(50ul),每位客户仅可领取一份;

2、蛋白电泳试剂包括:蛋白制备、蛋白定量、蛋白电泳、抗体孵育、转膜封闭、显色成像六类产品,具体以李记生物官网分类为准

3、单笔满额奖励可重复累积计算,兑换其他等值小礼物

4、集赞活动奖励仅68份,先到先得;每个课题组限领2份

5、以上所有活动均在关注“李记生物”微信公众号后有效