关于蛋白电泳的那些事

     免疫印迹又称蛋白质印迹(Western blotting),是通过凝胶电泳(SDS-PAGE)的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测,也可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。

 

 蛋白电泳步骤:

Western blot通常作为生物科研新手上路的第一个拦路虎,完整的实验可分为蛋白制备、蛋白定量、蛋白电泳、抗体孵育、转膜封闭、显色成像六大步骤。

其中蛋白电泳是十分重要的步骤,是一次成功的Western blot的基础,能直接决定能否得到清晰有效的蛋白条带。在本篇,小李子就稍微简介下传统蛋白电泳的流程:

1、清洗玻璃板

蘸点洗洁精轻轻擦洗,两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

2、 灌胶与上样

2.1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧,然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作前可以先往玻璃板间灌水,检查是否漏液)

2.2、按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配置,最后加入TEMED,之后摇匀即可灌胶,然后可以在胶上加一层水,液封后的胶凝的更快。(未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护)

2.3、当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝固,再等几分钟觉得差不多的时候就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。聚合时间由APS以及TEMED决定,通常在30min左右。2.4、按说明书配积层胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

2.5、趁积层胶聚合的这段时间,取适当体积样本混合1X SDS loading buffer(最好事前分装好,每次从冰箱里取一管即可),95~100°加热5min,若有沉淀可用稍低温度,比如45~55°加热1h达到变性的目的。

2.6、胶做好后连同玻璃板一起安装到电泳槽上,加入电泳缓冲液后加样器针头插至加样孔中缓慢加入蛋白Mark和样品(一般在第一个孔加入marker)

3、电泳

电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺(具体按照各实验室的惯例或者电泳槽的使用说明来操作),电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。

制胶过程常见问题以及原因

Q:两块玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平?

A:1、玻璃未洗净;2、温度会影响胶聚合,若受热不均匀,也会影响胶聚合不均;3、加入不均匀,应注意手法;4、灌胶后应进行压胶(可用水或正丁醇);5、过硫酸铵和TEMED加量过多导致凝胶过快而使胶不平;5、加入试剂后未摇匀,导致局部聚合剂浓度过高。

Q:Western-blot 制胶时好多泡泡怎么办?

A:1、玻璃板需用洗洁精洗干净后再用双蒸水冲洗、晾干;2、配胶时沿管壁缓缓加入各成分,用手轻轻摇匀,或者用枪头缓慢吹打且不要打到头;3、倒胶时,用枪沿一侧缓缓加入,不要打到底;4、封胶时,可用200ul枪头加水,减小压力;5、室温制胶可能由于温差及凝胶聚合反应放热产生气泡;6、分离胶凝好后,倒掉里面的水,用吸水纸吸干后再加浓缩胶,且迅速插梳子。

       实验室传统配胶需要手工一步步操作,非常繁琐且极大增加了实验失误的可能性,除此之外配胶、凝胶、跑胶等步骤都需要非常多的等待时间,在一定程度的拖慢了实验进程。

为了更好的服务广大实验客户,李记生物做了几款产品解决蛋白电泳中出现的问题。下面我们简单介绍下各款产品:

李记产品

规格

目录价

产品简述

EZ 快速蛋白电泳试剂盒

50块(1.0)

158

分不同浓度;配胶2min,无需计算所需溶液量,无需稀释

EZ Protein any KD PAGE蛋白电泳试剂盒

50块(1.0)

480

配胶2min、凝胶5-10分钟(上层可压平下层胶,无需额外水冲),本产品可承受高电压(250-300V),跑胶25-40分钟;不含TEMED、低丙烯酰胺;替代梯度胶,10-250KD一块分离

EZ Tris-Glycine蛋白电泳预制胶

10块/盒

288

150V,85-90mins;180V,1h;使用普通tris gly电泳缓冲液即可(不能分离<10kd蛋白);室温保存8个月,4℃保存12个月

EZ Hepes-Tris蛋白电泳预制胶

10块/盒

398

150V,40-50min(发热量少);试剂盒附赠专用缓冲液(可以分离5-10kd蛋白);分辨率高;室温保存12个月,4℃保存18个月

上海李记生物还可提供WB相关全套试剂:RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白定量试剂盒、蛋白Mark(10-180KD)、快速转膜缓冲液、BSA、ECL发光液(增强型、超敏型、飞克级)……

关于上海李记生物:

上海李记(Shanghai Life-iLab Biotech Co.,Ltd)坐落在美丽的上海川沙古镇,拥有1400平米的公司面积,是一家集研发、生产、销售为一体的生物高科技公司。主要产品:FBS、无血清细胞冻存液、细胞转染试剂、CCK-8,蛋白电泳全套试剂,无毒核酸染料、鼠尾直扩裂解液(以上试剂均可申请试用装)等涵盖细胞、分子方面各类实验试剂。

目前上海为公司直销模式,合作单位有:复旦大学、上海交通大学、同济大学、上海科技大学、上海药物所、中科院神经所、中科院细胞生化所、和元生物、和记黄埔、药明康德等多家科研单位和医药企业,在全国16个城市设有独家代理:北京、武汉、大连、昆明、南京等。

李记国产试剂,铸造百年经典。