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  免疫印迹法(WB)、免疫组化(IHC)和酶联免疫吸附实验(ELISA),是免疫学常用工具,主要应用于蛋白的定位、定性和定量。其中 WB实验是先通过进行跑电泳后,然后将分离好的蛋白质样品转移到固相载体上,再利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品,常用于定性和半定量。

图| WB实验流程图

 

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WB实验常见十问

1、细胞水平做WB,一般多少数量细胞提的够做WB?做组织样品的WB的时候,怎样处理样品?

答:一般5×10^6就足够了;特殊情况需根据自己的研究来确定。必须进行研磨、匀浆、超声处理(注意降温),蛋白质溶解度会更好,离心要充分(12000转/min,10-15min)。膜蛋白必须用更剧烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。

2、蛋白变性后可以存放多久?

答:-80℃,若没有反复取出冻融,保存一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。

3、同一蛋白样品能同时进行两种因子的WB检测吗?

答:当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品;有时如果抗体特异性高且效价高,同时使用2种一抗,可在一张膜上检测2种不同蛋白。

4、上样超载多少会对实验有影响?可以用什法来增加上样量?

答:正常超载30%不会有问题的,但不建议超载加样。可以浓缩样品,或者根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白,还可以考虑加大胶的厚度,以增大上样孔体积,比如尝试1.5mm厚的胶。

5、我所测定的蛋白分子量是100KD左右,理说分离胶应当采用7.5%,但资料却要求胶和浓缩胶均采用11%的配方,不知为何?

答:上述提到的两种凝胶均可以使用,因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内,但需注意不同浓度目的条带位置肯定会发生一定地偏移。具体参照如下图(李记有3款预混胶、预制胶,详情请参考“关于蛋白电泳那些事”)

6、一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗?

答:WB一般上样30-100μg不等,结果跟目的蛋白的表达丰度、上样量、一二抗的量以及孵育时间都有关系,也与显色时间长短有关。最开始摸条件时,各个步骤都可以量多一点时间长一点(背景也容易就出来了)。要拿到好的结果,如果抗体好的话比较容易,抗体不好的话就需要反复测试。

7、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗?

答:一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了,操作时保持冰浴,保持低温。除非有文献特别指明必须使用特殊方法,一般来说没有区别。

8、转膜后经丽春红染色的条带,为什么大蛋白分子的一端的转膜表现不是很好?

答:这是正常的,大分子的蛋白转移很慢,你延长转移时间和电流,大分子一端就会好的多,但是小分子的就有可能会变淡(转过的表现)。注意一点:丽春红染色较好,不是你的目标蛋白成功转移至膜上的标准,只能作为一个粗略参考。

9、做半定量WB,内参β-actin,GAPDH哪个好?

答:一般选用β-actin就可以,也可以使用GAPDH,但是如果做能量、代谢这方面的研究还是尽量选择β-actin。

10、请问一下PVDF膜和NC膜的区别是什么?什么PVDF膜用甲醇浸泡的目的?

答:PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合,有疏水作用但相对较弱,和蛋白接合较牢,不易脱落,结果较好。PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。硝酸纤维素膜(NC膜)是通过疏水作用来和蛋白质相联,反复洗几次后,蛋白容易掉下来,结果较差。