一、 李记GelRed,李记GelGreen——李记生物研发的两款核酸染料。

       据不完全统计,有强烈致癌、致畸作用的EB染料仍以90%的绝对优势占据核酸染料使用量榜首,在众多的EB替代染料中,名气最大的要数Life公司的SYBR系列、美国Biotium公司的GelRed,GelReen染料,其他替代染料要么是EB,吖啶橙改名,要么是国内不成熟的仿品,安全性毫无保障。Life公司的SYBR Green,SYBR Goad, SYBR Safe严格意义上来讲,不能称作安全染料。Biotium公司的GelRed,Gelgreen是一款真正意义上的安全染料,染色效果也好,但价格奇高,做一块50ml的琼脂糖凝胶,染料成本接近8元!
       2015年,李记生物经长期研发,开发成功国产GelRed,GelGreen染料。这两款产品全面优于SYBR系列染料,在灵敏度、荧光强度、稳定性等方面甚至优于原创厂家Biotium公司产品(见图1.),而价格仅为原厂2/3。
图1:I、Hela细胞与SYBR Green,李记GelRed及李记GelGreen在室温下孵育一小时,用Olympus荧光显微镜观察并拍照,与SYBR Green孵育的细胞显示出绿色荧光,表明染料已透过细胞膜进入细胞并与核酸结合。李记GelRed,李记GelGreen未显示荧光,说明李记染料未能透过细胞膜进入细胞。
II、SYBR Green,李记GelRed及李记GelGreen染料相同DNA浓度下染色效果。
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二、HRM专用荧光染料 —— LyGreen

        高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术,具有极高的敏感性,可以检测出单个碱基的差异,并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限,实现了真正的闭管操作。在突变扫描、单核苷酸多态性分析、甲基化研究、基因分型、序列匹配等方面HRM分析技术发挥着重要作用。
       HRM分析的一个必要条件是饱和染料,胜任这一任务的染料仅有:LC Green,SYTO 9, LyGreen等几个产品。
       LyGreen™饱和核酸染料是一种新型的的双链DNA结合饱和荧光染料,是新一代用于HRM分析的荧光染料,也可用于实时定量PCR(qPCR)。该染料结构上由两个单体染料分子通过一个弹性臂连接成一个二聚体,在没有dsDNA存在时,该结构呈无荧光环状结构,一旦有dsDNA出现,则恢复随机形态并与dsDNA结合发出强烈的绿色荧光。
与其他荧光染料如SYBR Green I 相比,LyGreen具有如下突出优点:
1)高灵敏度:在推荐浓度下使用时可以获得比SYBR Green I 更强的信号。
2)准确:饱和结合双链DNA全部小沟位置,变形时染料不迁移,荧光信号准确反映双链DNA变化情况;过量染料形成二聚体,而不游离,使得LyGreen对PCR的抑制远小于SYBR Green I,因此,使用LyGreen进行的qPCR实验可以使用快速PCR步骤。
3)高稳定性:在正常的储存、操作和PCR过程中不会被破坏。在缓冲溶液中的染料可以安全的储存在室温或冰箱里,也可以反复冻融。
4)安全性好:细胞膜穿透性测试表明,LyGreen几乎不能穿透细胞膜,安全性高。
5)兼容性:和SYBR Green I 光谱相似,使用不同品牌qPCR仪器时不许改变光谱元件设置,也无需改变操作步骤,qPCR完成后,无需加入其它核酸染料便能直接在凝胶成像系统下观察分析。
6)重复性好(如图2.):特殊设计染料,相同反应体系下,荧光信号释放仅与双链浓度有关,完美线性。
图2.: LyGreen染料用于绵羊FecB基因HRM分析.
HRM分析设备为LightCycler@480荧光定量PCR仪(德国罗氏)
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三、PikoGreen——一种极为灵敏的双链DNA定量荧光染料。

       对微量的双链 DNA 进行定量在各种生物学应用中都显得非常重要,例如 cDNA 文库的构建;用于亚克隆的 DNA 片段的纯化;定量 DNA 扩增产物,在药物中DNA 分子残留的测定等 。
       Picogreen染料是一种dsDNA定量荧光染料,基本不受ssDNA和RNA的影响,并且可以耐受一定浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白等干扰。目前使用Picogreen染料定量检测DNA已经广泛用于生物学检测,并被2010年版《中华人民共和国药典》选为药物残留DNA定量方法。但是价格贵,货期长,假货鱼目混珠等在市场上普遍存在。
        PikoGreen是李记生物自主研发的一款新型dsDNA定量荧光染料,其检测灵敏度高,可检测到pg级DNA;检测范围宽,可跨越4个数量级;特异性好。在最低检测限,稳定性等方面全面超越PicoGreen, 是PicoGreen的完美替代产品,价格仅为PicoGreen的1/2. PikoGreen具有如下突出优点:
1)灵敏:数量级较UV吸光读数更敏感,可节省样品;
2)特异性强:只结合dsDNA,特异性强,不受样品常规污染影响。传统紫外吸光法容易受样品中存在的单链DNA,蛋白,RNA等影响;
3)耐受性好:耐受较高浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白或琼脂糖,可以直接定量PCR扩增产物而无需从反应混合物中纯化DNA。
4)线性范围宽:PikoGreen dsDNA染料测定DNA浓度,在100pg/ml-100ng/ml范围内呈良好线性;荧光计兼容。
5)容易使用:在样品中加入染料,等待5-6分钟染色,然后读数即可,且适用于96和384孔板;与大多数基于荧光的酶标仪和可适用于各种DNA样品分析,PCR的分析、芯片样品、DNA损伤分析、酶活性分析、基因组DNA定量以及复杂混合物中dsDNA的检测和病毒DNA定量等多种领域。
6)PikoGreen dsDNA检测dsDNA的线性关系良好!(见图3、图4、图5)
 图 3.PikoGreen Broad Range dsDNA (Ex/Em 350/460nm)检测不同类型dsDNA,表现出良好线性关系。
图 4.分别使用PikoGreen Broad Range dsDNA 和Quant-iT检测calf thymus DNA,显示 PikoGreen dsDNA 测得的 DNA 样本线性关系更好,且动态测量范围更广
图5. 用PikoGreen Broad Range dsDNA梯度标准calf thymus DNA溶液所做的线性回归分析。
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李记生物研发部特别提醒:

       在生物技术飞速发展的今天,从事分子生物学研究的科员人员几乎每天都与核酸打交道,各种核酸染料也如食品中的味精不可或缺。不管我们对安全染料多么有信心,也不管您选择何种EB替代产品,总之还是奉劝大家牢记—-珍爱生命,请带手套。一时半会儿看不出问题,可年轻的我们,来日方长呢!还有,各种染料染色后的废弃试剂,请尽可能的规范处理,请做个负责任的实验人。