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  细胞冻存是细胞生物学研究及药物研发细胞实验中需要经常面对的常规操作。随着细胞越来越娇,人工越来越贵,各种细胞冻存液应运而生,如何从名目繁多的细胞冻存液中选择变成一个问题。本文从细胞冻存液分类,应用场景,使用效果等多方面加以阐释,希望能对如何选择细胞冻存液有所助益。

一、细胞冻存液的分类

  1. 从成分划分

(1)渗透性和非渗透性

  渗透性保护剂分子量小可渗透到细胞内,如甘油、DMSO、乙二醇等,其在细胞冷冻存完全凝固之前,渗入细胞内,降低细胞内外溶液中的电解质浓度,阻止细胞内水分外渗,避免细胞过分脱水皱缩,避免细胞内外环境冰晶的生成。
  非渗透性保护剂不能渗透到细胞内,多为大分子物质,如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉(HES)等。这些大分子优先同溶液中的水分子结合,降低了细胞外自由水的含量,使冰点降低,减少冰晶形成;同时,由于分子量大,使溶液中电解质浓度降低,减轻了溶质损伤。

  DMSO是一类渗透性细胞冻存保护试剂的代表,这类试剂包括:甘油、DMSO、乙烯醇和乙酰胺等。从上述几种物质渗透进出细胞的速度及细胞冻存效果看,DMSO效果更好,所以常规的细胞冻存液大都含有DMSO。DMSO在细胞冻存中保护细胞的原理是快速降低细胞内外电解质浓度、减少降温通过冰点时冰晶产生进而保护细胞免受伤害。传统的细胞冻存液是使用培养基、血清和DMSO按照一定的比例混合,其中DMSO的含量是10%。

(2)是否含血清

  细胞冻存液含血清是从细胞生长环境角度考虑对细胞进行保护,但含血清(属动物源成分)势必需要考虑细胞污染、批间稳定性等因素,另外随着细胞治疗研究逐渐成为热点,研究及生产过程的可预知、可控制要求,胎牛血清的使用液受到限制。包括李记生物在内的多家公司陆续开发成功不含血清的细胞冻存液,不含血清及动物来源性蛋白,减少病毒、霉菌和支原体等的污染。含血清的细胞冻存液一般采用程序降温(4℃→-20℃→-80℃→液氮),原因是血清中含有大量蛋白、细胞因子,血清含量较大的冻存细胞冻存液在温度快速降低时,会造成有较多蛋白沉淀。

(3)是否含DMSO

  作为渗透性细胞保护剂的代表,DMSO应用非常广泛,DMSO可以快速渗透进入细胞,是非程序性降温的基础。但是DMSO在低温下能保护细胞,但在常温下却对细胞有害,研究结果表明,培养液中DMSO浓度为10 %时,细胞生长抑制率近100 %;1%浓度时抑制率为35%,即使是0.04 %的浓度,DMSO对细胞的生长也有不利的影响。正是因为如此,细胞复苏后需要离心去除DMSO。在一些临床研究中,如果在细胞冻存中用到了DMSO,则需要说明其对细胞的毒副作用是否对细胞功能产生影响,也需要说明DMSO残留的问题。DMSO替代物的开发也是从渗透与非渗透两个方向研究,目前来看,渗透性的小分子化合物更具前景。李记生物从2015年开启不含血清,不含DMSO的细胞冻存液产品的研发;第一代低DMSO得GMP级别冻存液已于2022年上市,详情可关注李记生物微信公众号文章-搜索“冻存液”。

  1. 从操作过程划分

  是否需要程序降温是细胞冻存中需要考虑的另一个因素。常规细胞冻存液采用培养基+血清+DMSO配置,一般需要采用程序降温冻存细胞(先将冷冻管置于4℃冰箱10分钟,然后移至-20℃冰箱30分钟,再移至-80℃冰箱保存16-18个小时(或隔夜),最后才移至液氮罐中进行长期的储存)。目前包括李记生物已经有多款新型细胞冻存液上市,不需要程序降温,一步深冻,无需照看,节约了实验时间。

二、细胞冻存液选择

  细胞冻存液的选择须遵循几个原则:①细胞在冻存和溶解过程中的损伤减低到最小,细胞存活率高;②冻存细胞复温后,其的细胞生物学特性无明显影响;③细胞复温后,低温保护剂容易去除,成分清楚,对细胞、人体无毒副作用;④冻存保护剂可快速起效,减少操作步骤;⑤价格。

三、注意事项

  1. 常规细胞冻存液配方为基础培养基(含10%胎牛血清)与DMSO按9:1配制。DMSO溶于培养基时,DMSO加入培养基将释放大量热量,所以细胞冻存液需提前配制,避免烫伤细胞。注意,不能直接在细胞培养液中添加DMSO。
  2. 选择不含DMSO的细胞冻存液时,需确认替代成分的物质基础,如果替代成分较DMSO潜在危害更大,则得不偿失。
  3. 选用不含DMSO的细胞冻存液,需确认无细菌及细胞污染,要进行支原体检测。