一、  细胞培养支原体污染来源及主要支原体种类

支原体(Mycoplasma)是一种大小介于细菌和病毒之间(0.1 – 0.6μm),没有细胞壁、并独立生活原核生物,形态呈高度多形性,呈圆形、丝状或梨形。由于支原体直径较小,进行除菌过滤是,约1%的支原体可以直接穿过常规的0.22μm的微孔除菌滤膜,造成细胞的支原体污染。支原体污染的来源包括:(1)工作环境的污染,实验器材带来的污染;(2)操作者本身的污染(一些支原体在人体是正常菌群);(3)已受污染的培养基、血清,或用来制备细胞的原始组织或器官的污染;(4)污染支原体的细胞造成的交叉污染。

目前,已发现的支原体品种有100多种,但根据国内外相关研究发现,大约有二十多种支原体能污染细胞,有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。以下13种支原体污染在全部支原体污染中所占比例超过99%。(1)M. orale、(2)M.Arginini、(3)M.Hyorhinis、(4)A.Laidlawii、(5)M.Fermentans、(6)M. salivarium、(7)M.pirum、(8)M. hominis、(9)M. agalactiae、(10)M.bovis、(11)M. buccale、(12)M. arthritidis、(13)M. pulmonis。其中尤其是前四种:M.orale(口腔支原体)、M.arginini(精氨酸支原体)、M.hyorhinis(猪鼻支原体)和A.laidlawii(莱氏无胆甾原体)所占污染比例超过95%,前8种占比超过98%。

二、  支原体污染对细胞培养的危害

1.   支原体污染的普遍性

支原体污染是细胞培养领域遇到的全球性问题,据文献报道,综合美国食品药品监督管理局(FDA)、美国模式菌种收集中心(ATCC)等机构收到的相关数据,世界各国细胞系支原体污染的平均比例为30-60%。该数据未统计中国大陆的数据,但可以确定,大陆地区的支原体污染比例与此相当,或更严重。

表1.部分国家及机构细胞系污染数据统计

Cell Line

USA-ATCC

USA-FDA

Germany-DSM

Argentina

Japan-IFO

Rate

14%

15%

15%

65%

80%

2.   支原体污染的危害

根据已发表的支原体污染研究文献,支原体污染细胞后,几乎能影响每一个细胞参数。

1)   支原体污染可能导致细胞染色体的异常和损伤,改变细胞的代谢、生长、形状、附着。

2)   支原体影响被污染细胞的基因表达。相关研究表明,支原体污染的细胞系与对照组比较,有多达200个基因表达差异达2倍以上。

3)  导致MTT等细胞毒性实验结果严重错误。支原体对MTT有额外还原作用。

4)  支原体污染能耗尽营养物,促进代谢积累,重度支原体污染导致pH改变。

5)   诱导或抑制细胞因子表达,并改变培养细胞的代谢、增殖特征及形态。支原体污染可以直接影响L-arginine的代谢

6)   支原体污染可以诱导树突状细胞成熟,这对于开展人体免疫细胞的肿瘤治疗的影响将是灾难性的。

3.     支原体污染的隐蔽性

支原体大小约0.1 – 0.6微米,体积比病毒稍大,轻度到中度的支原体污染不会明显改变细胞培养液的浑浊度和pH值,也不会导致细胞形态或生长速度的明显改变,所以科研人员很难及时发现体外培养的细胞已经被支原体污染,进而改变了基因表达谱,显示虚假的实验数据和实验结果。通常情况下,如果不排除支原体污染因素,很多实验结果往往缺乏说服力。2013年,国际顶级期刊《Nature》明确要求,在涉及细胞培养的科研工作中,必须进行支原体检测,并排除其影响。

三、  支原体污染检测

1.     支原体检测方法概述

支原体污染严重干扰细胞实验结果,检测有无支原体污染的方法较多,可以根据自身实验室条件、检测方法便捷性等作出选择。

①电子显微镜或相差显微境观察。用扫描电镜或透射电镜,直观观察支原体形态。或者在细胞培养瓶内预置盖玻片,接种细胞在盖玻片上,培养24小时后取出用油镜观察。如有支原体,因支原体与细胞在不同平面,可发现支原体呈现暗色颗粒装。缺点:设备要求严格,检测成本高,不适合普通实验室日常常规检测。

②DNA荧光染色法,利用支原体没有细胞膜(壁)的特性,用荧光染料Hoechst 33258染色, Hoechst 33258能与支原体DNA结合着色,在荧光显微镜下观察,呈现绿色小点。缺点:灵敏度太低,当检测成阳性时,细胞经常已经严重污染。

③固体培养法,用支原体培养基大量增殖支原体,是相对可靠的支原体检测技术。缺点:耗时长,需要数周时间才能得到结果,不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测。此外,该方法不能检测猪鼻支原体,因为猪鼻支原体不能在固体培养基上形成可见的菌落,猪鼻支原体(M.Hyorhinis)约占所有支原体污染的20-50%。

④PCR法,提取细胞培养液,提取支原体,制备样品,根据支原体高度保守的16SrRNA序列设计引物(避免真核细胞或细菌DNA干扰),设置阴性,阳性对照,扩增产物经电泳后成像观察,可识别已发现的几乎全部100余种支原体。

⑤Quick Cell快速检测法,拓扑酶环化支原体DNA,在根据高保守区设计的引物引导下,采用特殊等温DNA扩增酶,61℃条件下,连续滚环式扩增支原体DNA 60分钟,根据有无支原体污染,随着扩增进程可目视实验结果。

⑥化学发光法,裂解支原体后,有底物情况下,支原体特异性的酶,能将ADP转化成ATP。ATP参与荧光素酶(Luciferase)催化底物荧光素(Luciferin)产生光的过程,所以可以通过催化底物荧光素导致的生物发光(Bioluminescence)信号来判别支原体DNA存在与否。

综上所述,在多种支原体检测方法中,受实验条件、实验时长、便捷性等因素限制,①-④仅在很少情况下得到应用。实际科研工作中,应用最为广泛的是 ⑤ PCR支原体检测法;⑥Quick Cell快速支原体检测法;⑦化学发光支原体检测法。

2.     几种最常用支原体检测方法比较

检测方法

Quick Cell快速检测法

化学发光法

PCR

检测原理 环化DNA等温连续扩增 支原体特异性酶检测 根据支原体DNA序列设计引物进行PCR扩增
实验条件 恒温水浴或PCR仪 -80℃超低温冰箱,多功能酶标仪或发光检测仪 常规PCR仪,电泳仪,成像系统
灵敏度 比PCR法高1-2个数量级 与PCR法相当 较灵敏
检测时长 1小时 25分钟 2-3小时
定性/定量 定性 定性,半定量 定性,半定量

污染
假阳性率

引物
假阳性率

样品制备

直接取上清,不需制备 需要样品制备 离心

检出
正确率

>99% >99.9% >80%

综合评价

1)简便、快速,任何实验室均可操作;2)扩增不受细胞代谢产物影响,高准确率 1)快速,准确;2)有特定设备要求,物流储存条件高。 1)较高的检出准确率;2)PCR反应易受培养基成分抑制,产生假阴性;3)需制备样品。

代表性
产品

Quick Cell 快速支原体检测(李记生物, CAT:C4056L1060)

*本产品由细胞专家李记生物独家研发

Quick Cell 支原体发光法检测试剂盒(李记生物,CAT:C4056L1065)

MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit (Lonza, CAT: LT07-710)

Quick Cell 支原体PCR检测试剂盒(李记生物,货号: C4056L1062)

Lookout Mycoplasma Detection Kit.(Sigma货号:MP0035)

3.     支原体检测策略及方法选择

①单个方法独立检测支原体(正确检出率80%-99.9%)

就单个检测方法及原理而言,“化学发光法”拥有最高的正确检出率(99.9%),用时最短,应为首选方法。可选产品为Lonza公司的MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit (CAT:C4056L1065,价格:约9800元/100次),或李记生物公司的“Quick Cell 支原体发光法检测试剂盒(CAT:C4056L1065,价格:1250元/50次)”。

若受实验室条件所限没有配备化学发光检测仪,或多功能酶标仪,建议选择“Quick Cell快速检测法”,该方法1小时出结果,避免了PCR法因细胞代谢产物抑制PCR反应导致的假阴性出现,正确检出率大于99%,对设备几乎无要求,可目测结果。产品可选李记生物公司的“Quick Cell支原体快速检测试剂盒(CAT:C4056L1060,价格:1250元/50次)”。

②多原理支原体检测策略

市场在售的所有支原体检测试剂盒,目前没有一种可以检出全部可能的支原体污染,如果从事细胞治疗、进行干细胞培养、生产血清、胰酶、培养液工作的科研人员,强烈建议选择两种以上检测方法,确保支原体正确检出率达到100%,避免关键实验不必要的损失。

细胞培养支原体污染是个普遍性问题,污染来源很多,根据国外生物实验室的规范做法,实验室的支原体检测要定期进行,一般一个月做一次支原体检测,可以第一时间确定支原体污染情况,显著降低或避免支原体污染对细胞培养相关实验的影响。

四、  支原体污染去除

1.     支原体污染预防

根据可能的支原体污染来源,在体外细胞培养过程中,要严格控制环境污染;严格实验操作;细胞培养基和实验器材、耗材要保证无菌;在不影响实验结果的前提下,可在细胞培养基中加入适量的特定抗生素;发现支原体污染后,要清除支原体,防微杜渐。

2.     支原体污染的去除及预防

因为支原体没有细胞壁,一般用于细胞壁合成的抗生素对支原体没有作用,如青霉素、万古霉素多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺药物普遍没什么效果。对支原体最有抑制活性及常用于支原体去除的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮。在低浓度时,这些抗生素不会产生耐药性,且对哺乳动物细胞的毒性较小。四环素和大环内酯能结合30S和50S核糖体亚基,从而抑制支原体蛋白质合成,喹诺酮抑制DNA旋转酶。因此可以在细菌DNA复制及蛋白质合成两个层面上抑制细菌生长,明显增强除菌效果。

3.      支原体去除试剂选择

选择支原体去除试剂需要注意几个关键几点: ①细胞毒性小,毒性大的试剂在去除支原体的同时,会杀死细胞;  ②支原体去除效果,选择广谱试剂,去除多种支原体,以及细菌,真菌等; ③操作简便,没有二次污染;要考虑操作使用是否方便,因为如果使用起来比较麻烦,首先是费时费力,另外可能会带来二次污染。目前市场上有多种支原体去除&预防试剂可选。包括李记生物的Quick Cell支原体预防/去除试剂,美国GenDEPOT公司的Cellmaxin,罗氏公司的BM-Cyclin,Biolnd的BIOMYC-1,BIOMYC-2,BIOMYC-3,以及Invivogen 公司的Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment 等。

Quick Cell支原体预防及去除试剂和Cellmaxin都是从蛋白和DNA两个层面去除支原体,抗菌谱广。不同在于Quick Cell的使用者可以灵活选择单独或联合使用两种成分,分别或同时在蛋白或DNA层面去除支原体污染,细胞毒性更小。作用周期1-2周,支原体去除率大于92%。去除预防兼顾

BM-Cyclin包含泰妙菌素(BM-Cyclin 1)和二甲胺四环素(BM-Cyclin 2)两种成分,抑制支原体及细菌生长,高效去除培养细胞中已感染的支原体。适用于多种培养细胞,无明显副作用,又不影响细胞本身的代谢,而且处理过的细胞不会重新感染支原体。BM-Cyclin需联合使用,作用周期2周,可消除80%以上的支原体。不确定能否预防。

BIOMYC-1基于抗生素泰妙菌素,由真菌pleurotus mutilus 产生。 BIOMYC-2基于二甲胺四环素,四环素衍生物。此两种抗生素溶液通常按先后联合使用2-3次循环约一周以上,可取得良好的效果。BIOMYC-3 基于抗生素环丙沙星,属于氟喹酮类。许多支原体被证明对BIOMYC-3敏感,需要根据支原体种类使用。处理周期2周,能去除90%的支原体。是否可以预防支原体目前还不能确定。

Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment也是两种抗生素的混合物,包含两个针对支原体的有效成分,作用于蛋白质合成和DNA复制阶段,对许多细菌和真核细胞则没有影响。作用周期2周,去除效率未知。有两个浓度包装,去除用高浓度,预防用低浓度。