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细胞培养支原体污染

——来源——

(1)工作环境的污染,实验器材带来的污染;

(2)操作者本身的污染(一些支原体在人体是正常菌群);

(3)已受污染的培养基、血清,或用来制备细胞的原始组织或器官的污染;

(4)污染支原体的细胞造成的交叉污染。

——危害——

(1)细胞系支原体污染的平均比例为30-60%;

(2)《Nature》等期刊要求细胞实验必须做支原体检测;

(3)支原体污染细胞后,几乎能影响每一个细胞参数:

  a、细胞染色体的异常和损伤

b、MTT实验结果严重错误

c、L-Arginine的代谢受影响

d、200个基因表达差异达2倍以上

e、PH值改变

——检测——

检测方法

(1)PCR法:提取细胞培养液,提取支原体,制备样品,根据支原体高度保守的  16SrRNA序列设计引物(避免真核细胞或细菌DNA干扰),设置阴性,阳性对照,扩增产物经电泳后成像观察,可识别已发现的几乎全部100余种支原体。

(2)化学发光法:裂解支原体后,有底 物情况下,支原体特异性的酶,能将ADP  转化成ATP。ATP参与荧光素酶(Luciferase)催化底物荧光素(Luciferin)产生光的过程,所以可以通过催化底物荧光素导致的生物发光(Bioluminescence)信号来判别支原体DNA存在与否。

(3)Quick Cell快速检测法:拓扑酶环化支原体DNA,在根据高保守区设计的引物引导下,采用特殊等温DNA扩增酶,61℃条件下,连续滚环式扩增支原体DNA 60分钟,根据有无支原体污染,随着扩增进程可目视实验结果。

概述

 PCR法:

(1)较高的检出准确率;正确率大于85%                    

(2)需制备样品;

(3)PCR反应易受培养基成分抑制,产生假阴性。

化学发光法:

(1)快速,准确,正确率大于99.9%

(2)有特定设备要求,物流储存条件高。

Quick Cell快速检测法(李记生物独家研发):

(1)准确,正确检出率大于99%

(2)快速,一步操作,一小时反应,目视结果,几乎不用任何设备,任何实验室均可操作

(3)简便,不需制备样品,反应不受细胞代谢产物影响

预防措施

  根据可能的支原体污染来源,在体外细胞培养过程中,要严格控制环境污染、实验操作;细胞培养基和实验器材、耗材要保证无菌;在不影响实验结果的前提下,可在细胞培养基中加入适量的特定抗生素;发现支原体污染后,要清除支原体,防微杜渐。

去除措施

  因为支原体没有细胞壁,一般用于细胞壁合成的抗生素对支原体没有作用,如青霉素、万古霉素多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺药物普遍没什么效果。对支原体最有抑制活性及常用于支原体去除的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮。在低浓度时,这些抗生素不会产生耐药性,且对哺乳动物细胞的毒性较小。四环素和大环内酯能结合30S和50S核糖体亚基,从而抑制支原体蛋白质合成,喹诺酮抑制DNA旋转酶。因此可以在DNA复制及蛋白质合成两个层面上抑制支原体生长,明显增强除菌效果。

选择支原体去除试剂需要注意几个关键几点:

①细胞毒性小,毒性大的试剂在去除支原体的同时,会杀死细胞;

②支原体去除效果,选择广谱试剂,去除多种支原体,以及细菌,真菌等;

③操作简便,没有二次污染;要考虑操作使用是否方便,因为如果使用起来比较麻烦,首先是费时费力,另外可能会带来二次污染。

支原体去除&预防试剂可选:

(1)李记生物的Quick Cell支原体预防/去除试剂  

(2)美国GenDEPOT公司的Cellmaxin

(3)罗氏公司的BM-Cyclin,Biolnd的BIOMYC-1,BIOMYC-             2,BIOMYC-3

(4)罗氏公司的Invivogen 公司的Plasmocin™ prophylactic           和Plasmocin™ treatment 

试剂功效

1、Quick Cell支原体预防及去除试剂和Cellmaxin都是从蛋白和DNA两个层面去除支原体,抗菌谱广。

不同在于:Quick Cell的使用者可以灵活选择单独或联合使用两种成分,分别或同时在蛋白或DNA层面去除支原体污染,细胞毒性更小。作用周期1-2周,支原体去除率大于92%。去除预防兼顾

2、BM-Cyclin包含泰妙菌素(BM-Cyclin 1)和二甲胺四环素(BM-Cyclin 2)两种成分,抑制支原体及细菌生长,高效去除培养细胞中已感染的支原体。 适用于多种培养细胞,无明显副作用,又不影响细胞本身的代谢,而且处理过的细胞不会重新感染支原体。BM-Cyclin需联合使用,作用周期2周,可消除80%以上的支原体。不确定能否预防。

3、BIOMYC-1基于抗生素泰妙菌素。 由真菌pleurotus mutilus 产生。 BIOMYC-2基于二甲胺四环素,四环素衍生物。 此两种抗生素溶液通常按先后联合使用2-3次循环约一周以上,可取得良好的效果。 BIOMYC-3 基于抗生素环丙沙星,属于氟喹酮类。 许多支原体被证明对BIOMYC-3敏感,需要根据支原体种类使用。处理周期2周,能去除90%的支原体。是否可以预防支原体目前还不能确定。

4、Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment也是两种抗生素的混合物。包含两个针对支原体的有效成分,作用于蛋白质合成和DNA复制阶段,对许多细菌和真核细胞则没有影响。作用周期2周,去除效率未知。有两个浓度包装,去除用高浓度,预防用低浓度。