高分辨率熔解曲线（HRM）分析指南

　　HRM(High Resolution Melting analysis，高分辨熔解曲线)同许多荧光PCR技术一样，是利用特定dsDNA染料可以插入DNA双链小沟中（PCR产物）的特性，通过实时监测升温过程中dsDNA解链，荧光染料脱落，荧光信号减弱或消失的过程，高分辨记录熔解曲线，从而对样品进行检测。HRM技术利用dsDNA的物理性质，准确反映DNA序列碱基配对特异性与解链温度变化的情况，无需使用特异性标记探针，不受突变种类和突变位点的限制，具有高灵敏度和特异性、高通量、操作简单灵活、成本低等优点。实验室检测证明，在PCR反应前或反应后加入饱和dsDNA染料，对HRM分析，效果相同。在PCR后加入，可闭管进行HRM分析，无需凝胶电泳。HRM分析，不损伤PCR产物，用于HRM分析的PCR产物仍可用于电泳、胶回收、测序等一系列后续操作。HRM可应用于核酸突变扫描、基因分型、甲基化检测、短串联重复序列分析、序列匹配和RNA编辑等多方面研究，已越来越受到国内外核酸分子实验室的欢迎和重视。

　　对于目前绝大多数的突变分析方法来说，都很难鉴定出纯合子序列突变。在一些不同种类的小的扩增片段中，高分辨率熔解曲线则显示出了鉴定纯合子序列突变的能力，这种方法能鉴定出大多数的纯合突变。HRM技术在遗传学研究方面也带来很大便利，只需在PCR反应体系中加入双链DNA饱和荧光染料，在PCR反应之后再花15 分钟，就可以完成96或384个样品的DNA变异扫描。采用这种方法，当片段的大小在400bp或者更小时，灵敏性最高。

一、HRM分析条件

1. 设备

　　PCR扩增产物的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列，序列中如有一个碱基发生突变，都会改变dsDNA的解链温度。但是这种变化差异极小，只有零点几摄氏度，HRM技术需要区分Tm值差异极小的样品，以鉴别单个碱基的差异，因此，对温度分辨率的要求相当高，如果仪器的分辨率不高，是无法检测的。孔间温度差异（温度均一性：Tm的标准偏差为0.020～0.264℃），孔间温度均一性要达到0.264℃以内才能保证HRM分析结果的准确性。熔解速率，最低要求0.1℃/秒。数据密度，最低要求10个数据点/℃。目前市场上HRM分析仪器的供应商，有专门用于HRM分析的仪器，也有附带HRM功能的Real Time PCR仪。这些厂家包括：Roche, QIAGEN, Idaho Technology。市场上认可度较高的一些设备包括: HR-1、LightScanner-32、LightScanner-96和LightScanner-384(Idaho Technology Inc)，可采集55～95℃的荧光信号，变温速率是0.02～0.1℃／s，每秒钟可以采集200个数据资料。LightCycler 480s(Roche Diagnostics, Germany)和Rotor-Gene6000(Corbett)等传统实时定量PCR仪加装高分辨率熔解模块后，采用qPCR-HRM方法可以实现对目的核酸片段的定量和定性检测。

2. 染料

　　进行HRM分析的另一个必要条件是饱和染料。用于HRM分析的染料必须满足两个条件。首先，必须是饱和染料。所谓饱和染料是指染料必须能饱和结合于DNA双链所有小沟位置，也就是染料相对于dsDNA要相对过量，以使dsDNA没有更多位置结合染料，在dsDNA升温解链时，饱和染料从双链上脱落，荧光信号同步减弱，准确反应出样品熔解温度（Tm）、熔解曲线的不同（如图1-A）。SYBR Green I染料广泛用于qPCR，但属于非饱和染料，不能封闭dsDNA的所有小沟位置，远未将DNA双螺旋结构中的小沟饱和。这样，DNA双链高温逐步变性时，部分荧光染料分子会随机结合到尚未解链的双链DNA空置的小沟位置，染料分子发生重排，造成荧光信号混乱，特异性下降，不能准确反映dsDNA解链过程（如图1-B）

图1：dsDNA解链前后荧光染料结合情况。A(左图):饱和染料在dsDNA解链时，荧光分子同步脱落，信号减弱。B(右图):不饱和染料在dsDNA解链时，荧光分子重新结合于未解链的dsDNA部位，荧光信号没有变化，不能反应样品熔解温度(Tm)。

        其次，染料不能抑制PCR反应。SYBR Green I染料不是饱和染料，加大染料浓度，不但不能饱和结合dsDNA小沟位置，还会抑制PCR反应进行，造成扩增反应无序，混乱。

        用于HRM分析荧光染料如LC Green, Ly Green, eva Green等均为饱和染料，能饱和结合于PCR反应产物的双链小沟内，同时这些染料不会抑制PCR反应。Ly Green为2015年最新推出的HRM分析专用染料，除具有饱和染料、不抑制PCR等特点外，荧光信号稳定、实验重复性好时期突出优点（如图2）。

图2. LyGreen染料用于绵羊FecB基因HRM分析。

HRM分析设备为LightCycler@480荧光定量PCR仪(德国罗氏)

二、HRM分析流程

1. 引物设计合成

据基因序列应用Oligo软件设计、合成正向引物，反向引物（或依据参考文献）。将引物稀释成10mmol/L的工作浓度,-20℃保存备用。

2. 反应体系

注：1）50µL反应，根据引物及扩增DNA长度不同，可进行优化。

2）染料在反应前加入或反应后加入对反应影响不大，反应前加入，可实现闭管操作。

3. 扩增及HRM程序

 

三、HRM分析局限性及解决办法    

        1）. 熔解设备自身温差。在所有的熔解系统中，孔与孔之间都存在微小的温度差异，故影响检测的灵敏性。如果孔与孔间的温度差异为0.1℃，则最终的样品熔解温差也可能是0.1℃。因此，HRM对仪器温度的均一性要求非常高。为解决这一问题，可以在PCR体系中加入2种温度内标，低温时熔解和高温时熔解。HRM仪上的分析软件可以根据这2种内标的熔解峰在熔解曲线中的位置来纠正孔与孔之间的温度差异，可显著提高检测的灵敏性。

        2）. PCR反应体系和反应条件。PCR反应体系中，核酸模板质量要经过检测，浓度要均一。在分析多样本时，模板外的其他共同组分要先混合均匀后，再分别加入样品模板，以保证反应体系的均一性。若在PCR反应后加入饱和荧光染料，通常不需要对反应条件做任何改变；若在PCR反应前加入染料，可以实现真正的闭管操作，避免污染。但此时需要对原来的反应条件做一定的改变，通常需要增加Mg2+浓度2～3 mmol/L，增加退火温度1～5℃。随着Mg2+浓度的增加，Tm值也会升高，当Tm值超过熔解设备所允许的最高温度时，还需要加入二甲基亚砜DMSO(10％)或甜菜碱(0.5 mol/L)来降低Tm值。在某些情况下，为快速找到反应体系最适的退火温度，需要做梯度PCR试验。在PCR反应程序的最后，一定要加入解链和退火的步骤，以增加PCR产物的杂合度，提高试验的分辨率和准确度。

         3）. 引物的二聚体。PCR产物高纯度的PCR特异性产物是获得HRM分析结果较高特异性的前提，在PCR引物设计时，一定要避免引物的二聚体和发卡结构，尽量降低基因组其他片段的非特异性结合。根据所用扩增酶的情况，要严格控制PCR反应的循环数，以降低非特异性扩增增加的风险。根据试验目的，要严格控制扩增片段的长度。试验结果表明，随着扩增片段长度的增加，HRM结果的灵敏度和特异性会降低，当扩增片段长度为400-1000 bp时，检测的灵敏度为96.1％，异性为99.4％。对于一些差异只有1-2 bp的基因片段进行分型时，需要借助探针才能解决。扩增子不能太长，当检测大片段如整个外显子或内含子的突变位点时，就要使用多对引物，将大片段分别扩增检测。同其他任何基于PCR反应的突变检测一样，HRM不能检测外显子、内含子或整个基因等大片段的缺失突变。

         4）. 转换纯合突变子检测。目的片段突变或多态位点的类型在转换、颠换、插入和缺失4大类碱基突变类型中，杂合突变子产生的Tm值差异最大，颠换纯合突变子的Tm值差异在0.8～1.4℃之间，HRM技术可以对其准确分型。但转换纯合突变子产生的Tm值差异通常小于0.4℃，HRM技术不能对其准确分型，此时需要采用小片段法或非标记探针法。使用小片段法时，片段长度一般设计为40～90 bp，包含1个SNP位点为宜。使用探针法时，熔解曲线上会出现2个峰图，可以进行2次SNPs分析，且探针与其互补区结合形成的双链部分更短，更能增加试验的灵敏度，从而增加对纯合突变子的分型准确性。

         5）. 样品的提取方法一致。样品基因组提取方法样品基因组不同的提取方法会对PCR后产物熔解曲线的形状和分析结果产生很大的影响，因此，待分析样品的提取方法要一致。为找出较为合适的提取方法，实验室可根据自身条件设计不同基因组提取方法对HRM结果影响的试验，找到较为理想的提取方法或较为理想的基因组提取试剂盒。

         6）. 饱和荧光染料的差异LC-Green、Syt09、ResoLight Dye和Ly Green,等饱和荧光染料的性质差异不大，可以相互替代，试验时只需要对PCR缓冲液和反应条件做微小的调整即可。SYBR Green I染料为非饱和荧光染料，在检测核酸微小变异时存在缺陷，因此一些研究者们不建议采用。

四、HRM技术展望

        HRM技术具有高通量、高灵敏度和特异性、操作简单灵活、成本低、对DNA分子无损害、闭管操作等诸多优点。

        在畜牧业方面，通过对畜禽基因组突变位点的关联性分析和连锁性分析，HRM技术可以鉴定出更多的与畜禽特定经济性状相关的SNPs位点，增加畜禽参考群育种值估计的准确性，还可以增加畜禽分子疾病的检出率，并为其遗传疾病和基因突变所致疾病的分子诊断提供革命性手段。           

        在农业方面，HRM技术将增加作物遗传标记位点的密度，加快作物高产、抗逆性等优良性状的改良进度。随着消费者食品安全意识的增强和行业竞争的日趋激烈，对食品微量成分种类和含量的检测日益重要，HRM技术因其较高的灵敏度和特异性，必将发展成为一种可靠便捷的检测手段。

        在人类疾病的诊断方面，HRM技术必已经从试验研究走向临床诊断，成为人类分子疾病临床诊断的新手段。因此，HRM技术的应用范围将会进一步拓宽，并越来越受到核酸研究者的重视。

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