细胞增殖检测技术已广泛应用于分子生物学、遗传学、肿瘤生物学、免疫学、药理和药代动力学等研究领域。细胞通过分裂的方式增殖,细胞增殖是生物体的重要生命特征 。细胞增殖的同时,在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞,活细胞在总细胞中所占的百分比叫做细胞活力。
检测细胞存活与增殖的方法主要包括观察 DNA 合成含量和检测细胞代谢活性两种,前者主要是DNA前体物质(胸腺嘧啶核苷类似物)掺入法,比如 BRDU、EDU 法;后者主要为 MTT、XTT、MTS、CCK-8、WST-1 及 WST-8 法等。在后者中现在灵敏度更高、更适合高通量的方法就是基于细胞内 ATP 含量来进行检测。

      本文中从多个维度对上海李记生物新推出的 CellTimer-Light 细胞活力检测试剂盒(以下简称 CT-Li)的性能进行评判,积极推广这种市面尚未铺开的优质产品。因为只有活细胞才能产生 ATP,在细胞凋亡和坏死时ATP又会迅速下降的原理,利用化学发光法检测(一般使用冷光仪或能化学发光的多功能酶标仪)细胞内 ATP 含量(图 1),从而反应细胞活力。

图 1. CellTimer-Light 细胞活力检测试剂盒原理

• 快速简便:仅需 10 分钟即可获取数据;只需一步操作,加入试剂后无需吹打、震荡混匀,且全程室温操作,无需 37℃ 孵育。相较于 MTT、CCK8、Alamar blue 等方法相比,大大提升效率、降低工作量(图2)
• 灵敏度高: 最低可探测到 10 个细胞。
• 稳定性好: 发光信号持久稳定在 96 孔板中,最高 1.0×105个/孔,可在接近20 小时内维持良好的线性(R2>0.995) ,线性范围超过知名国际品牌产品标示的 5-6 万/孔;在 384 孔板中,最高 27500 个/孔,在 13 小时内(未检测更长时间)其线性相关系数 R2>0.998(图 3) 。
• 适用性广: 拥有最低探测 4 个细胞的灵敏度以及超宽的线性范围,96 孔板最高 1.0×105 个/孔,384 孔板最高 27500 个/孔几乎能够满足所有实验的需求,稳定的发光信号和简易的操作保证高通量操作的需求(图 4、5)。
• 质量过硬: 4℃ 存放,信号半衰期超过一个月,且性能仍然能够达到检测要求;30℃ 时半衰期为 2 天,即使 56℃ 半衰期也长达 1 小时(图 6)。经多次测试,一般反复冻融 5 次性能不会出现明显改变。

图 2. CT-Li 试剂准备及实验操作流程

图 3. 加入等体积 CT-Li 试剂后, Jurkat 细胞线性相关系数随时间的变化。 A. 白色 96孔板中, 100μ l Jurkat 细胞最高 100000 个/孔(蓝色虚线),2 倍稀释,共设置 11 个浓度,对照组为等体积 1640 培养基含 10 %胎牛血清( FBS),红色实线为采用最高 50000 个细胞拟合。 B. 白色 384 孔板中, 25μ l Jurkat 细胞最高 27500 个/孔(蓝色虚线),2 倍稀释,共设置 11 个浓度,对照组为等体积 1640 培养基含 10 %胎牛血清( FBS),红色实线为采用最高 13750 个细胞拟合。

图 4. 96 孔板中各时间点发光信号与细胞数的相关性。各数据点取自图 3A 中相应原始数据,小图为低细胞量段曲线放大图。

图 5. 384 孔板中各时间点发光信号与细胞数的相关性。各数据点取自图 3B 中相应原始数据,小图为低细胞量段曲线放大图。

图 6. CT-Li 试剂在不同存储温度下发光信号随时间变化情况。 检测方法如下,同一批次试剂取 3 份存储于 -20℃,其余分别存放于相应温度并在对应时间点取样立即冻存于 -20℃,样品全部收集完成后用 50μ l 2μ M ATP 溶液( 1640 培养基含 10%FBS) 加入等体积 CT-Li 试剂检测。 56℃ 极端情况下, 信号半衰期为 1 小时; 30℃ 存放,半衰期为 2 天; 4℃ 保存,信号半衰期超过 37 天,而即使信号衰减一半也完全能够满足检测的需求。

与国外大牌对比实验

       评价产品质量的最直接方法是正面对比,我们在 Siha、HepG2、293T 三款细胞上面分别用了上海李记 CT-Li 试剂和国外 P 公司的 CellT** 试剂分细胞数和时间进行了严谨的产品对比验证。实验数据如图 7(篇幅有限,仅展示 Siha)

图7,细胞相同(Siha),分别比较 CT-Li 试剂和 CellT** 两种产品在不同检测时间(10min、120min、240min)时的吸光值。从图中可以看出,每孔细胞数在 500 到 32000 万之间时,随着时间的延长,两种试剂的发光值都有所下降,但组间倍数关系无明显变化,相关性(R²)无明显变化,说明两种试剂都具有较好的稳定性。