吲哚花菁绿(ICG,indocyanine green)是经过FDA认证的菁染料,出于安全考虑,后期应用于活体(人、动物、细胞)的染料在结构上都和ICG有相似或相近之处。cy系列染料是Amersham公司(目前为GE公司)最初开发的染料体系,它的桥环由苯并吲哚变为吲哚环,并在吲哚的苯环上对称地引入硫酸根基团,水溶性得到很大改善,分子量降低后对大分子的亲和力有所增加。cy系列菁染料多带有羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS ester)、异硫氰酸酯(NCS)等活性基团,可与蛋白质、多肽、DNA或其他生物分子中的羟基、氨基或巯基以化学键的方式键合,表征生物分子的特性,形成具有生物功能的标记衍生物,广泛被用于抗体、多肽、小分子等多种荧光探针的合成中,可以说是目前使用最为广泛的一类近红外染料。cy染料应选择GE、李记生物等公司产品,化工企业提供的cy染料产品,一般不作为活体成像使用。

 

一、Cy染料在活体成像的应用领域

1. 标记特异性抗体
  在CY菁染料标记蛋白的研究中,除了牛血清白蛋白以外最先开始涉及的功能性物质是抗体。从起初与IgG结合,用荧光光纤免疫传感器(FFOI,fluorescent fiber-optic immunosensor)考察抗原抗体反应,到现在连接特异性的单克隆抗体片段,对动物全身进行免疫荧光显影,分析片段在体内的分布代谢情况。分析cy-抗体复合物在不同时间不同器官中的荧光强度变化,可对抗体的靶向性、清除率等有更直观的评价。不过,染料抗体衍生物在降低背景噪音和非特异性吸附方面还有待进一步完善。
2. 标记特异性多肽(Conjugating to peptides)
  在肿瘤诊断和治疗中,与菁染料衍生物结合的多肽主要有两种:其一是针对肿瘤表面过量表达的受体;另一种则针对肿瘤相关酶类。前者的报道很多,如生长激素抑制素、表皮生长因子,甚至一些特殊设计过的短肽,都可以被用来靶向结合肿瘤,现在更趋向于一些只有十几个氨基酸的环肽,因为它分子量小易于接近肿瘤部位,且呈环状构形不易被分解。Cy系列染料均能利用自身携带的活性基团直接与环肽结合,部分此类探针检测发现,在近红外光学显影和放射显影在浅表的分辨率相似,但在深层组织中前者的信噪比更高。针对酶类研究一般是设计酶特异性荧光探针,这种与Cy系列染料结合的检测技术除了在体内定位时有显著优势外,亦可作为体外检测手段与一些常用技术结合,辅助确定组织中该酶的存在。
3. 与药物载体结合(Conjugating to drug carriers)
  现在生物可降解的、靶向性高的载体是药学制剂领域的一个研究热点,而近红外染料为研究这些载体的体内行为提供了一种新思路。这些载体主体一般是由多聚谷氨酸、PGC等多聚物组成的骨架,骨架侧链上有很多活性基团,可以同时连接上数个靶向功能模块和染料分子,所以在装载药物之前就可以先利用荧光显影对该载体的靶向性等作出评价。这个领域的报道比较少,现在多选用结构较小的单克隆抗体片段或叶酸这些小分子作为药物载体上的靶向模块与Cy系列染料、ICG衍生物等结合,进一步完善对这些载体的研究可以为疾病确定和定位给药带来新的希望。

 

二、cy染料活化基团的选择

  根据需要标记的抗原、抗体、酶、多肽等分子所带的可标记基团的种类(氨基、醛基或巯基)以及分子的酸碱性,选择相应的活化染料和反应条件。为减少空间位阻影响,可在cy染料与被标记物之间加入交联臂结构。常见抗体、抗原、酶、多肽对应的染料活化基团如下:
1.标记氨基的活化基团:NHS ester (N-羟基丁二酰亚胺酯)。
2.标记醛基的活化基团:Hydrazide酰肼。多的用于神经元细胞的电极失踪和神经缝隙连接研究
3.标记巯基的活化基团:Maleimide,马来酰亚胺 

 

三、小动物活体成像操作流程

  以研究肿瘤靶向信号肽为例,介绍小动物活体成像实验流程。本实验人工给小鼠接种皮下肿瘤,然后制备cy7-信号肽复合体(探针),通过尾静脉注射小鼠,在不同时间点做活体成像分析,观察cy7-信号肽复合体(探针)在体内的特异性分布。
1.实验动物准备(动物模型建立)
1) SPF级 BALB/C裸鼠,5~8 周龄,18~20克,自由进食、水。饲养1周后接种细胞,分组或混编分笼饲养。12小时光照/日,明暗交替。相对湿度50%±10%、温度23±2℃。
2) 细胞培养瓶中培养CNE-1细胞(实验室根据具体情况),取对数生长期,胰酶常规消化,离心,富集,利用无菌PBS清洗细胞,离心,富集,重复上述过程3次,最后用无菌PBS液调整细胞浓度为l×107个/ml,收集细胞于离心管内。
3) 细胞接种取0.1ml CNE-1细胞悬浮液接种于每只小鼠的双后肢大腿。根部皮下,双后肢皮下注射相同肿瘤细胞数,每处1×106个细胞。
4) 成瘤观察继续饲养,观察细胞接种后的生长状况,大约5-6天后可见瘤块,待约1-2 周后,肿瘤长至约0.5-0.8cm直径,开始做体内多肽靶向实验。
注意:
1)动物分组、阴性对照、阳性对照根据具体实验设置;
2)实验动物接种肿瘤后,注射荧光探针前,可根据实验目的给药或做其他处理。
2.标记复合物制备
利用Cy7 NHS ester上琥珀酰亚胺基与信号肽末端以及侧链氨基的反应,将荧光分子Cy7 NHS ester连接到多肽上,形成Cy7-信号肽的荧光多肽复合物(探针)。
1) Cy7反应液准备。避光条件下,将1mg Cy7 NHS ester溶于200μL二甲基亚砜,终浓度5 mg/ml,20μl/管分装,每离心管含Cy7 NHS ester 100 μg,用铝箔纸包好,置于-80 ℃冰箱避光冷冻备用。
2) 带标记信号肽准备。取2mg多肽,溶解于0.1 M NaHCO3 溶液,终浓度为1 mg/ml。
3) Cy-信号标记复合物生产。按照信号肽:Cy7-NHS=7:1(molar ratio)的比例,混合信号肽溶液与Cy7-NHS 溶液,放置于恒温震荡反应器中,室温25℃避光震荡反应4小时(如图1.)
4) 标记复合物纯化。用SephadexG-15凝胶柱纯化、收集标记复合物,低温干燥浓缩。
注意:
1)染料标记复合物生成的反应条件需根据待标记大分子与荧光染料活性基团具体进行调整。
2)NHS用于标记氨基,因此标记复合物生成反应溶液中需要除去带氨基的成分,一般通过多次半渗透后浓缩的办法把待标记大分子溶液中的其他带氨基成分去除。
3)标记复合物的纯化,需根据复合物的分子大小,理化及生物学性质选择合适方法。

图1:cy NHS ester与氨基反应形成标记复合物

3. 活体内靶向分布实验
1) 小鼠于成像前6小时开始禁食,以降低因胃肠道食物引起的背景干扰。
2) 通过小鼠尾静脉注射0.1ml Cy7-信号肽溶液(浓度1mg/mL),或Cy7标记复合物稀释后,于裸鼠尾静脉注射200μL(浓度0.5 mg/mL)[最佳用量和时间需要客户根据自己的仪器和药物试剂等条件优化]。对照组实验小鼠注射从尾静脉注射游离cy7染料溶液(1mg/mL)0.1ml
3) 注射后,分别于1h、2h、15h、24h、48h后,用10%水合氯醛溶液按0.35ml/100mg体重腹腔注射麻醉小鼠(第一次麻醉后应给小鼠脱毛,减少毛发产生的背景荧光干扰),用胶带固定在治疗床上,根据肿瘤部位,采取合适体位(如图2.)
4) 小动物活体成像系统分别对小鼠全身及肿瘤部位荧光扫描成像, Ex/Em(nm): 749/776。
5) 记录动物在体内发射荧光的成像图片,分析荧光复合物(探针、药物)的分布情况。比较不同分组小鼠(阴性阳性对照组)的荧光分布情况。
6) 成像结束后,根据实验需要,选择是否要解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器,进行成像分析。
注意:
1) 根据实验需要通过尾静脉注射、皮下移植、原位移植等方法接种细胞、组织或已标记的探针。在建模时应认真考虑实验目的和cy染料(cy5, cy5.5, cy7)荧光波长,建模时不宜接种深部脏器和观察荧光,但可以观察皮下瘤和解剖后脏器直接成像。深部脏器和体内转移的观察大多选用荧光素酶标记。
2) 不同cy染料活性部位可标记不同基团,确保反应体系内去除与待标记基团竞争性结合cy染料的试剂,本例中,用cy7 NHS ester标记多肽氨基,应通过半渗透等方法尽量去除反应体系内其他携带氨基的分子,避免携带cy7染料的物质被注射进小鼠体内影响实验结果。
3) 本例中通过标记探针与特异性靶点的结合改变荧光信号的体内分布,在一些设计中,也可通过探针与靶点结合导致的空间位置改变,淬灭荧光信号。

图2:注射标记探针、麻醉、脱毛后的实验小鼠
图3:注射cy-多肽标记复合物的小鼠与对照组分别成像