Biotin TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

产品货号:

AC12L082/AC12L083

产品规格:

20T/50T

产品价格:

1880/3480

产品描述

细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解,这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律,所产生的不同长度的 DNA 片段约为 180 bp-200 bp的整数倍,表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状 Ladder 图谱,本试剂盒采用TUNEL 法,应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 在凋亡细胞断裂DNA 的 3´-OH 末端催化掺入生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-X-dUTP)。随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)特异结合,最后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞,从而可以通过普通光学显微镜观察并计数凋亡细胞。  由于正常的或正在增值的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3´-OH 形成,很少能被染色。TUNEL 法可以选择性的对凋亡细胞直接进行原位检测, 而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞,是一种更快速、直接的检测手段。

订购信息

产品名称

货号

规格

价格

Biotin TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

AC12L082

20 T

1880

Biotin TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

AC12L083

50 T

3480

产品组分

组分

20 T

50 T

A. Biotin TUNEL Reaction Buffer

2×0.5 mL

5×0.5 mL

B. TdT酶

20 μL

50 μL

C. Streptavidin-HRP

20 μL

50 μL

D. Streptavidin-HRP稀释液

1 mL

2×1.25 mL

E. DAB显色液A

100 μL

250 μL

F. DAB显色液B

1 mL

2.5 mL

G. DAB显色液C

50 μL

125 μL

H. Proteinase K (2 mg/mL)

40 μL

100 μL

I. DNase I (2 U/μL)

5 μL

13 μL

J. 10 × DNase I Buffer

100 μL

260 μL

运输与保存

蓝冰运输。-20℃避光保存;组分 A、E、G 需避光保存,避免反复冻融。有效期见外包装。 

组分 A、E、F、G 使用时请佩戴口罩、手套,接触皮肤,请立即用大量水冲洗。

实验材料(自备)

PBS 缓冲液( pH~7.4)

4% 多聚甲醛in PBS

0.3% H2O2  in PBS(新鲜配制)

70%乙醇(自选)

脱蜡溶剂(石蜡切片样本)

使用方法

  1. 样本准备:

  细胞样品

(1)可选:准备一份阴性对照样本(加入不含TdT酶的TUNEL 反应液)。

(2)PBS 清洗细胞2次。

(3)细胞固定:加入适量 4%多聚甲醛(pH 7.4)溶液, 4℃ 放置 30 min。

(4)PBS清洗细胞2次。

(5)通透细胞:加入冰上预冷的 70%乙醇,在-20℃孵育 4 h。细胞能在 70%乙醇中-20℃的条件下保存1周。或者细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透,室温放置 20 min。

(6)PBS 清洗细胞2次。

(7)封闭细胞:每孔加入100μL左右的配制于PBS中的0.3 % H2O2溶液,轻敲孔板使其充分覆盖细胞,室温避光封闭 30 min,用1×PBS清洗细胞2次。

石蜡组织切片

(1)室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片2次,每次5 min,以彻底脱掉石蜡。

】:二甲苯有毒,易挥发,请在通风橱中进行此操作。

(2)室温下,将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗2次,每次5 min。

(3)室温下,将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇(95%、90%、80%、70%)中,每种浓度各漂洗1次,每次5 min。

(4)室温下,将切片浸没于纯水中漂洗1次,每次3 min,再将切片浸没于1×PBS中漂洗1次,每次3 min,用滤纸小心吸干切片样本周围多余液体。

(5)用免疫组化笔在切片样本周围描绘样品轮廓,以便下游通透与标记。

(6)按1:100的比例,将2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀释,使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL稀释好的Proteinase K溶液,使溶液覆盖全部样本区域,室温孵育20 min(Proteinase K的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。

】:蛋白酶K可以帮助渗透组织,但延长孵育时间可能导致切片脱落,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min,4 µm左右的片子可以用10 min,但30 µm左右的可用30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。

(7)PBS浸润清洗切片2次,每次5 min。

(8)封闭:加入适量配制于 PBS 中的 0.3% H2O2溶液(新鲜配制),室温孵育 30 min,以灭活切片内源的过氧化氢酶。

(9)PBS浸润清洗切片2次,每次5 min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

冰冻切片

(1)将冰冻切片放置于室温的片架上,室温20 min,晾干。

(2)将载玻片浸没在4%多聚甲醛溶液(in PBS)中,室温固定30 min。

(3)PBS 浸润清洗切片2次,每次5 min。

(4)用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。

(5)按1:100的比例, 将2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀释, 使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL稀释好的Proteinase K溶液,使溶液覆盖全部样本区域,室温孵育10 min(Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。

】:蛋白酶K可以帮助渗透组织,但延长孵育时间可能导致切片脱落,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min,4 µm左右的片子可以用10 min,但30 µm左右的可用30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。

(6)PBS浸润清洗切片2次,每次5 min。

(7)封闭:加入适量配制于 PBS 中的 0.3% H2O2溶液(新鲜配制),室温孵育30 min,以灭活切片内源的过氧化氢酶。

(8)PBS清洗样品3次,每次5min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

阳性处理(仅阳性对照进行此步骤,其他样品直接进行TUNEL反应步骤)

(1)按1:10的比例用diH2O将10 × DNase I Buffer稀释成1 × DNase I Buffer备用。

(2)滴加100 µL 1 × DNase I Buffer到已通透的样本上,室温平衡5 min。

(3)用1 × DNase I Buffer 以1:100稀释DNase I (2 U/μL),使其为终浓度20 U/mL的工作液。

(4)轻轻吸掉多余液体,加入100 μL浓度为20 U/mL DNase I工作液,室温孵育10 min。

(5)轻轻吸掉多余液体,PBS清洗样品2次。

  1. TUNEL 反应

(1)配制TUNEL反应液(即用即配)。

 

1个样品

5个样品

10个样品

TdT酶

1μL

5μL

10μL

Biotin TUNEL Reaction Buffer

49μL

245μL

490μL

TUNEL反应液总体积

50μL

250μL

500μL

(2)每个样品加入 50 μL TUNEL 反应液,37℃避光孵育 60 min,组织样本需要 2 h(阴性对照样品加入不含 TdT 酶的TUNEL 反应液)。

】:50μL TUNEL反应液适合涂片、切片或96孔板、48孔板、 24孔板或12孔板的一个孔,如果是6孔板中的一个孔TUNEL反应液建议使用100μL。如果待检测的样品为涂片、切片或在24 孔板、12孔板或6孔板中,建议在滴加TUNEL反应液后在样品上覆上防蒸发膜,防止TUNEL反应液蒸发,并且使TUNEL反应液均匀覆盖样品。

(3)PBS清洗反应后的样品3次,每次5 min。

  1. Streptavidin-HRP工作液和DAB显色液的配制

(1)Streptavidin-HRP工作液的配制(即用即配):

 

1个样品

5个样品

10个样品

Streptavidin-HRP

1μL

5μL

10μL

Streptavidin-HRP稀释液

49μL

245μL

490μL

Streptavidin-HRP工作液总体积

50μL

250μL

500μL

(2)DAB 显色液的配制(即用即配):

 

1个样品

5个样品

10个样品

DBA显色液A

5μL

25μL

50μL

DBA显色液B

42.5μL

212.5μL

425μL

DBA显色液C

2.5μL

12.5μL

25μL

DBA显色液总体积

50μL

250μL

500μL

 

  1. 样品显色:

(1)向样品滴加 50 μL Streptavidin-HRP 工作液,37℃避光孵育 30 min。 】:50 μL Streptavidin-HRP 工作液适合涂片、切片或 96 孔板、48 孔板、24 孔板或 12 孔板的一个孔,如果是 6 孔板,建议使用 100 μL。为防止 Streptavidin-HRP 工作液蒸发,建议在样品上覆上防蒸发膜。

(2)PBS 清洗样品 3 次,每次 5 min。

(3)向样品滴加 50 μL DAB 显色液,室温孵育 5-30 min 或在显微镜下根据颜色的发展情况掌握染色时间。 】:如果显色很强可短于 5 min 即停止显色,如果显色很弱,可以适当延长显色时间,甚至显色过夜。

(4)PBS 清洗样品 3 次,每次 5 min。

(5)选做:用苏木素染色液或甲基绿染色液进行细胞核染色。随后用 PBS 清洗 3 次。

(6)直接光学显微镜下观察。针对石蜡切片,如果需要封片,使用 95%乙醇脱水 5 min,再用 100%乙醇脱水 2 次,每次 3 min,再用二甲苯透明 2 次,每次 5 min。

注意事项

  1. 本产品仅限于科学实验研究使用,不得用于临床诊断、治疗等领域。
  2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
  3. 叠氮化钠对HRP有抑制作用,实验中请勿使用含有叠氮化钠的试剂。

常见问题与分析

现象

可能原因

建议

非特异性染色

有些细胞或组织的核酸酶或聚合酶的酶活性水平较高

取细胞或组织后立即固定并且要充分固定

TdT 酶反应时间过长或Tunel反应过程中反应液渗漏,细胞或组织表面不能保持湿润。

控制反应时间,并确保TdT 酶能很好地覆盖样品。

使用了不适当的固定液,例如一些酸性固定液

采用推荐的固定液

标记率低

如果以乙醇或甲醇固定的样品则标记效率较低(因为在固定时染色质未能与蛋白质交联,而在操作中丢失)

采用推荐的固定液

固定时间过长,导致交联程度过高

减少固定时间

贴壁细胞如果使用药物诱导凋亡,会使发生凋亡细胞的贴壁性会减弱

在凋亡诱导结束后,可以对多孔板进行1000g离心5min,然后再吸出培养基并用PBS洗涤。如果没有适合的离心机,请注意操作轻缓,防止发生凋亡的细胞在洗涤时被洗去。后续整个操作也需要轻缓

染色背景很高

支原体污染

使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染

TdT 酶反应时间过长

注意控制反应时间

高速分裂和增殖的细胞,有时也会出现细胞核中的DNA 断裂

在非高增殖期取样检测

DAB 孵育时间过长

减少DAB 染色时间

Biotin-X-dUTP 的非特异性结合

在TdT 酶反应之后,再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。

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Biotin TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

产品货号:

AC12L082/AC12L083

产品规格:

20T/50T

产品价格:

1880/3480

产品描述

细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解,这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律,所产生的不同长度的 DNA 片段约为 180 bp-200 bp的整数倍,表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状 Ladder 图谱,本试剂盒采用TUNEL 法,应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 在凋亡细胞断裂DNA 的 3´-OH 末端催化掺入生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-X-dUTP)。随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)特异结合,最后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞,从而可以通过普通光学显微镜观察并计数凋亡细胞。  由于正常的或正在增值的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3´-OH 形成,很少能被染色。TUNEL 法可以选择性的对凋亡细胞直接进行原位检测, 而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞,是一种更快速、直接的检测手段。

订购信息

产品名称

货号

规格

价格

Biotin TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

AC12L082

20 T

1880

Biotin TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

AC12L083

50 T

3480

产品组分

组分

20 T

50 T

A. Biotin TUNEL Reaction Buffer

2×0.5 mL

5×0.5 mL

B. TdT酶

20 μL

50 μL

C. Streptavidin-HRP

20 μL

50 μL

D. Streptavidin-HRP稀释液

1 mL

2×1.25 mL

E. DAB显色液A

100 μL

250 μL

F. DAB显色液B

1 mL

2.5 mL

G. DAB显色液C

50 μL

125 μL

H. Proteinase K (2 mg/mL)

40 μL

100 μL

I. DNase I (2 U/μL)

5 μL

13 μL

J. 10 × DNase I Buffer

100 μL

260 μL

运输与保存

蓝冰运输。-20℃避光保存;组分 A、E、G 需避光保存,避免反复冻融。有效期见外包装。 

组分 A、E、F、G 使用时请佩戴口罩、手套,接触皮肤,请立即用大量水冲洗。

实验材料(自备)

PBS 缓冲液( pH~7.4)

4% 多聚甲醛in PBS

0.3% H2O2  in PBS(新鲜配制)

70%乙醇(自选)

脱蜡溶剂(石蜡切片样本)

使用方法

  1. 样本准备:

  细胞样品

(1)可选:准备一份阴性对照样本(加入不含TdT酶的TUNEL 反应液)。

(2)PBS 清洗细胞2次。

(3)细胞固定:加入适量 4%多聚甲醛(pH 7.4)溶液, 4℃ 放置 30 min。

(4)PBS清洗细胞2次。

(5)通透细胞:加入冰上预冷的 70%乙醇,在-20℃孵育 4 h。细胞能在 70%乙醇中-20℃的条件下保存1周。或者细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透,室温放置 20 min。

(6)PBS 清洗细胞2次。

(7)封闭细胞:每孔加入100μL左右的配制于PBS中的0.3 % H2O2溶液,轻敲孔板使其充分覆盖细胞,室温避光封闭 30 min,用1×PBS清洗细胞2次。

石蜡组织切片

(1)室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片2次,每次5 min,以彻底脱掉石蜡。

】:二甲苯有毒,易挥发,请在通风橱中进行此操作。

(2)室温下,将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗2次,每次5 min。

(3)室温下,将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇(95%、90%、80%、70%)中,每种浓度各漂洗1次,每次5 min。

(4)室温下,将切片浸没于纯水中漂洗1次,每次3 min,再将切片浸没于1×PBS中漂洗1次,每次3 min,用滤纸小心吸干切片样本周围多余液体。

(5)用免疫组化笔在切片样本周围描绘样品轮廓,以便下游通透与标记。

(6)按1:100的比例,将2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀释,使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL稀释好的Proteinase K溶液,使溶液覆盖全部样本区域,室温孵育20 min(Proteinase K的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。

】:蛋白酶K可以帮助渗透组织,但延长孵育时间可能导致切片脱落,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min,4 µm左右的片子可以用10 min,但30 µm左右的可用30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。

(7)PBS浸润清洗切片2次,每次5 min。

(8)封闭:加入适量配制于 PBS 中的 0.3% H2O2溶液(新鲜配制),室温孵育 30 min,以灭活切片内源的过氧化氢酶。

(9)PBS浸润清洗切片2次,每次5 min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

冰冻切片

(1)将冰冻切片放置于室温的片架上,室温20 min,晾干。

(2)将载玻片浸没在4%多聚甲醛溶液(in PBS)中,室温固定30 min。

(3)PBS 浸润清洗切片2次,每次5 min。

(4)用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。

(5)按1:100的比例, 将2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀释, 使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL稀释好的Proteinase K溶液,使溶液覆盖全部样本区域,室温孵育10 min(Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。

】:蛋白酶K可以帮助渗透组织,但延长孵育时间可能导致切片脱落,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min,4 µm左右的片子可以用10 min,但30 µm左右的可用30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。

(6)PBS浸润清洗切片2次,每次5 min。

(7)封闭:加入适量配制于 PBS 中的 0.3% H2O2溶液(新鲜配制),室温孵育30 min,以灭活切片内源的过氧化氢酶。

(8)PBS清洗样品3次,每次5min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

阳性处理(仅阳性对照进行此步骤,其他样品直接进行TUNEL反应步骤)

(1)按1:10的比例用diH2O将10 × DNase I Buffer稀释成1 × DNase I Buffer备用。

(2)滴加100 µL 1 × DNase I Buffer到已通透的样本上,室温平衡5 min。

(3)用1 × DNase I Buffer 以1:100稀释DNase I (2 U/μL),使其为终浓度20 U/mL的工作液。

(4)轻轻吸掉多余液体,加入100 μL浓度为20 U/mL DNase I工作液,室温孵育10 min。

(5)轻轻吸掉多余液体,PBS清洗样品2次。

  1. TUNEL 反应

(1)配制TUNEL反应液(即用即配)。

 

1个样品

5个样品

10个样品

TdT酶

1μL

5μL

10μL

Biotin TUNEL Reaction Buffer

49μL

245μL

490μL

TUNEL反应液总体积

50μL

250μL

500μL

(2)每个样品加入 50 μL TUNEL 反应液,37℃避光孵育 60 min,组织样本需要 2 h(阴性对照样品加入不含 TdT 酶的TUNEL 反应液)。

】:50μL TUNEL反应液适合涂片、切片或96孔板、48孔板、 24孔板或12孔板的一个孔,如果是6孔板中的一个孔TUNEL反应液建议使用100μL。如果待检测的样品为涂片、切片或在24 孔板、12孔板或6孔板中,建议在滴加TUNEL反应液后在样品上覆上防蒸发膜,防止TUNEL反应液蒸发,并且使TUNEL反应液均匀覆盖样品。

(3)PBS清洗反应后的样品3次,每次5 min。

  1. Streptavidin-HRP工作液和DAB显色液的配制

(1)Streptavidin-HRP工作液的配制(即用即配):

 

1个样品

5个样品

10个样品

Streptavidin-HRP

1μL

5μL

10μL

Streptavidin-HRP稀释液

49μL

245μL

490μL

Streptavidin-HRP工作液总体积

50μL

250μL

500μL

(2)DAB 显色液的配制(即用即配):

 

1个样品

5个样品

10个样品

DBA显色液A

5μL

25μL

50μL

DBA显色液B

42.5μL

212.5μL

425μL

DBA显色液C

2.5μL

12.5μL

25μL

DBA显色液总体积

50μL

250μL

500μL

 

  1. 样品显色:

(1)向样品滴加 50 μL Streptavidin-HRP 工作液,37℃避光孵育 30 min。 】:50 μL Streptavidin-HRP 工作液适合涂片、切片或 96 孔板、48 孔板、24 孔板或 12 孔板的一个孔,如果是 6 孔板,建议使用 100 μL。为防止 Streptavidin-HRP 工作液蒸发,建议在样品上覆上防蒸发膜。

(2)PBS 清洗样品 3 次,每次 5 min。

(3)向样品滴加 50 μL DAB 显色液,室温孵育 5-30 min 或在显微镜下根据颜色的发展情况掌握染色时间。 】:如果显色很强可短于 5 min 即停止显色,如果显色很弱,可以适当延长显色时间,甚至显色过夜。

(4)PBS 清洗样品 3 次,每次 5 min。

(5)选做:用苏木素染色液或甲基绿染色液进行细胞核染色。随后用 PBS 清洗 3 次。

(6)直接光学显微镜下观察。针对石蜡切片,如果需要封片,使用 95%乙醇脱水 5 min,再用 100%乙醇脱水 2 次,每次 3 min,再用二甲苯透明 2 次,每次 5 min。

注意事项

  1. 本产品仅限于科学实验研究使用,不得用于临床诊断、治疗等领域。
  2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
  3. 叠氮化钠对HRP有抑制作用,实验中请勿使用含有叠氮化钠的试剂。

常见问题与分析

现象

可能原因

建议

非特异性染色

有些细胞或组织的核酸酶或聚合酶的酶活性水平较高

取细胞或组织后立即固定并且要充分固定

TdT 酶反应时间过长或Tunel反应过程中反应液渗漏,细胞或组织表面不能保持湿润。

控制反应时间,并确保TdT 酶能很好地覆盖样品。

使用了不适当的固定液,例如一些酸性固定液

采用推荐的固定液

标记率低

如果以乙醇或甲醇固定的样品则标记效率较低(因为在固定时染色质未能与蛋白质交联,而在操作中丢失)

采用推荐的固定液

固定时间过长,导致交联程度过高

减少固定时间

贴壁细胞如果使用药物诱导凋亡,会使发生凋亡细胞的贴壁性会减弱

在凋亡诱导结束后,可以对多孔板进行1000g离心5min,然后再吸出培养基并用PBS洗涤。如果没有适合的离心机,请注意操作轻缓,防止发生凋亡的细胞在洗涤时被洗去。后续整个操作也需要轻缓

染色背景很高

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TdT 酶反应时间过长

注意控制反应时间

高速分裂和增殖的细胞,有时也会出现细胞核中的DNA 断裂

在非高增殖期取样检测

DAB 孵育时间过长

减少DAB 染色时间

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