Cy3 TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

产品货号:

AC12L084/AC12L085

产品规格:

20T/50T

产品价格:

1880/3480

产品描述

细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解,这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律,所产生的不同长度的 DNA 片段约为 180 bp-200 bp 的整数倍,表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状 Ladder 图谱,本试剂盒采用 TUNEL 法,应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡细胞断裂DNA 的3´-OH末端催化掺入Cy3-dUTP。 Cy3-dUTP标记的 DNA 可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。 TUNEL 法可以选择性的检测凋亡细胞, 而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。TUNEL 实验中, TdT 酶催化 dUTP 掺入断裂的 DNA 链的3´-OH末端。抗原标记的 dUTP(如digoxin-dUTP、生物素-dUTP),因为它可以直接进行原位检测,是一种更快速、直接的检测手段。

订购信息

产品名称

货号

规格

价格

Cy3 TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

AC12L084

20 T

1880

Cy3 TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

AC12L085

50 T

3480

产品组分

组分

20 T

50 T

A.TUNEL Equilibration Buffer

2×1 mL

5 mL

B.Cy3 TUNEL Reaction Buffer

2×0.5 mL

5×0.5 mL

A. C.TdT Enzyme

20μL

50μL

B. D.Proteinase K (2 mg/mL)

40μL

100μL

C. E.DNase I (2 U/μL)

5μL

13μL

D. F.10 × DNase I Buffer

100μL

260μL

运输与保存

蓝冰运输。-20℃保存;组分B需避光保存于-20℃,避免反复冻融。有效期见外包装。

注】:组分A、B中含有有毒、致癌成分Sodium cacodylate trihydrate和Cobaltous chloride,使用时请佩戴口罩、手套,接触皮肤后,请立即有大量水冲洗,废液请按有毒物质处理。

实验材料(自备)

PBS 缓冲液(pH~7.4)

4%多聚甲醛(in PBS)

牛血清白蛋白(BSA) 或正常的羊、牛血清

70%乙醇(自选)

脱蜡溶剂(石蜡切片样本)

蛋白酶K(石蜡切片样本)

使用方法

1.样本准备:

细胞样品

(1)可选:准备一份阴性对照样本(加入不含 TdT 酶的TUNEL 反应液)。

(2)PBS清洗细胞2次。

(3)细胞固定:加入适量 4%多聚甲醛(pH 7.4)溶液, 4℃ 放置 30 min。

(4)PBS清洗细胞2次。

(5)通透细胞:加入冰上预冷的 70%乙醇,在-20℃孵育 4 h。细胞能在 70%乙醇中-20℃的条件下保存1周。或者细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透,室温放置 20 min。

(6)PBS清洗细胞2次。

石蜡组织切片

(1)室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片2次,每次5 min, 以彻底脱掉石蜡。

】:二甲苯有毒,易挥发,请在通风橱中进行此操作。

(2)室温下,将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗2次,每次5 min。

(3)室温下,将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇(95%、90%、80%、70%)中,每种浓度各漂洗1次,每次5 min。

(4)室温下,将切片浸没于纯水中漂洗1次,每次3 min,再将切片浸没于1×PBS中漂洗1次,每次3 min,用滤纸小心吸干切片样本周围多余液体。

(5)用免疫组化笔在切片样本周围描绘样品轮廓,以便下游通透与标记。

(6)按1:100的比例, 将2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀释, 使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL稀释好的Proteinase K溶液, 使溶液覆盖全部样本区域, 室温孵育20 min(Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。

】:蛋白酶K可以帮助渗透组织,但延长孵育时间可能导致切片脱落,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min,4 µm左右的片子可以用10 min,但30 µm左右的可用30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。

(7)PBS 浸润清洗切片2次,每次 5 min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

】:这一步必须把蛋白酶K洗涤干净,否则会严重干扰后续的标记反应。

冰冻组织切片

(1)将冰冻切片放置于室温的片架上,室温20 min,晾干。

(2)将载玻片浸没在4%多聚甲醛溶液(in PBS)中,室温固定30 min。

(3)PBS 浸润清洗切片2次,每次5 min。

(4)用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。

(5)按1:100的比例, 将2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀释, 使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL稀释好的Proteinase K溶液, 使溶液覆盖全部样本区域,室温孵育10 min(Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。

】:蛋白酶K可以帮助渗透组织,但延长孵育时间可能导致切片脱落,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min,4 µm左右的片子可以用10 min,但30 µm左右的可用30 min,需摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。

(6)PBS 浸润清洗切片2次,每次 5 min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

阳性处理(仅阳性对照进行此步骤,其他样品直接进行TUNEL反应步骤)

(1)按1:10的比例用ddH2O将10 × DNase I Buffer稀释成1 × DNase I Buffer备用。

(2)滴加100 µL 1 × DNase I Buffer到已通透的样本上,室温平衡5 min。

(3)用1 × DNase I Buffer 以1:100稀释DNase I (2 U/μL),使其为终浓度20 U/mL的工作液。

(4)轻轻吸掉多余液体,加入100 μL浓度为20 U/mL DNase I工作液,室温孵育10 min。

(5)轻轻吸掉多余液体,PBS清洗样品2次。

  1. TUNEL 反应

(1)每个样本加入 100 μL TUNEL 平衡缓冲液,孵育 5 min。

(2)预先配制 TUNEL 反应混合液:每个样本需要已加入1 μL TdT 酶的 50 μL TUNEL 反应缓冲液。

(3)弃去平衡缓冲液,用滤纸小心吸去切片样本周围的多余液体,每个样本加入 50 μL TUNEL 反应混合液。

a.贴壁细胞,用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。37℃避光孵育 60 min。

b.悬浮细胞,可加入微孔板中,采用微孔板振荡器进行孵育或每隔 15 min 温和的震荡反应管,使之充分反应。37℃避光孵育 60 min。

c.组织样本,用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。将样本平放于湿盒内,37℃恒温箱孵育2 h,湿盒底部铺一张含少量水的纸巾保持湿度。37℃避光孵育 2 h。

d.去掉反应液,在1×PBS 的染色缸中浸泡润洗2次,每次5 min。再使用适量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100,其中含 5 mg/mL BSA 的缓冲液清洗样本3 次,每次5 min,以降低背景。

(5)(可选)复染:每个样本滴加浓度为2 μg/mL 的DAPI染液,避光室温孵育10 min。染色完后,轻轻去掉染液,并将样本在1×PBS中浸泡润洗3次,每次5 min。

(6)(可选)封片:将切片样本先纯水浸没5 min,再放入70%乙醇浸没5 min,再80%乙醇浸没5 min,90%乙醇浸没5 min,95%乙醇浸没5 min,无水乙醇浸没5 min,最后将切片样本置于染色缸中以新鲜的二甲苯浸泡透明化处理2次,每次5 min(通风厨中操作)。脱水完成后,擦去切片周围的液体,每个切片样本滴加50 μL抗荧光淬灭封片液,盖上盖玻片,用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片,去除气泡以使封片完全。

(7)用荧光显微镜或流式细胞仪观察、分析,Cy3的激发波长为550nm,发射波长为570nm(凋亡细胞应被标记上明亮的红色荧光,没有加入TdT 酶的阴性对照样本未被标记上荧光)。

注意事项

  1. 本产品仅限于科学实验研究使用,不得用于临床诊断、治疗等领域。
  2. 荧光染料均存在淬灭问题,保存和使用过程中请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
  3. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

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Cy3 TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

产品货号:

AC12L084/AC12L085

产品规格:

20T/50T

产品价格:

1880/3480

产品描述

细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解,这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律,所产生的不同长度的 DNA 片段约为 180 bp-200 bp 的整数倍,表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状 Ladder 图谱,本试剂盒采用 TUNEL 法,应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡细胞断裂DNA 的3´-OH末端催化掺入Cy3-dUTP。 Cy3-dUTP标记的 DNA 可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。 TUNEL 法可以选择性的检测凋亡细胞, 而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。TUNEL 实验中, TdT 酶催化 dUTP 掺入断裂的 DNA 链的3´-OH末端。抗原标记的 dUTP(如digoxin-dUTP、生物素-dUTP),因为它可以直接进行原位检测,是一种更快速、直接的检测手段。

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产品名称

货号

规格

价格

Cy3 TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

AC12L084

20 T

1880

Cy3 TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

AC12L085

50 T

3480

产品组分

组分

20 T

50 T

A.TUNEL Equilibration Buffer

2×1 mL

5 mL

B.Cy3 TUNEL Reaction Buffer

2×0.5 mL

5×0.5 mL

A. C.TdT Enzyme

20μL

50μL

B. D.Proteinase K (2 mg/mL)

40μL

100μL

C. E.DNase I (2 U/μL)

5μL

13μL

D. F.10 × DNase I Buffer

100μL

260μL

运输与保存

蓝冰运输。-20℃保存;组分B需避光保存于-20℃,避免反复冻融。有效期见外包装。

注】:组分A、B中含有有毒、致癌成分Sodium cacodylate trihydrate和Cobaltous chloride,使用时请佩戴口罩、手套,接触皮肤后,请立即有大量水冲洗,废液请按有毒物质处理。

实验材料(自备)

PBS 缓冲液(pH~7.4)

4%多聚甲醛(in PBS)

牛血清白蛋白(BSA) 或正常的羊、牛血清

70%乙醇(自选)

脱蜡溶剂(石蜡切片样本)

蛋白酶K(石蜡切片样本)

使用方法

1.样本准备:

细胞样品

(1)可选:准备一份阴性对照样本(加入不含 TdT 酶的TUNEL 反应液)。

(2)PBS清洗细胞2次。

(3)细胞固定:加入适量 4%多聚甲醛(pH 7.4)溶液, 4℃ 放置 30 min。

(4)PBS清洗细胞2次。

(5)通透细胞:加入冰上预冷的 70%乙醇,在-20℃孵育 4 h。细胞能在 70%乙醇中-20℃的条件下保存1周。或者细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透,室温放置 20 min。

(6)PBS清洗细胞2次。

石蜡组织切片

(1)室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片2次,每次5 min, 以彻底脱掉石蜡。

】:二甲苯有毒,易挥发,请在通风橱中进行此操作。

(2)室温下,将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗2次,每次5 min。

(3)室温下,将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇(95%、90%、80%、70%)中,每种浓度各漂洗1次,每次5 min。

(4)室温下,将切片浸没于纯水中漂洗1次,每次3 min,再将切片浸没于1×PBS中漂洗1次,每次3 min,用滤纸小心吸干切片样本周围多余液体。

(5)用免疫组化笔在切片样本周围描绘样品轮廓,以便下游通透与标记。

(6)按1:100的比例, 将2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀释, 使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL稀释好的Proteinase K溶液, 使溶液覆盖全部样本区域, 室温孵育20 min(Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。

】:蛋白酶K可以帮助渗透组织,但延长孵育时间可能导致切片脱落,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min,4 µm左右的片子可以用10 min,但30 µm左右的可用30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。

(7)PBS 浸润清洗切片2次,每次 5 min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

】:这一步必须把蛋白酶K洗涤干净,否则会严重干扰后续的标记反应。

冰冻组织切片

(1)将冰冻切片放置于室温的片架上,室温20 min,晾干。

(2)将载玻片浸没在4%多聚甲醛溶液(in PBS)中,室温固定30 min。

(3)PBS 浸润清洗切片2次,每次5 min。

(4)用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。

(5)按1:100的比例, 将2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀释, 使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL稀释好的Proteinase K溶液, 使溶液覆盖全部样本区域,室温孵育10 min(Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。

】:蛋白酶K可以帮助渗透组织,但延长孵育时间可能导致切片脱落,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min,4 µm左右的片子可以用10 min,但30 µm左右的可用30 min,需摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。

(6)PBS 浸润清洗切片2次,每次 5 min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

阳性处理(仅阳性对照进行此步骤,其他样品直接进行TUNEL反应步骤)

(1)按1:10的比例用ddH2O将10 × DNase I Buffer稀释成1 × DNase I Buffer备用。

(2)滴加100 µL 1 × DNase I Buffer到已通透的样本上,室温平衡5 min。

(3)用1 × DNase I Buffer 以1:100稀释DNase I (2 U/μL),使其为终浓度20 U/mL的工作液。

(4)轻轻吸掉多余液体,加入100 μL浓度为20 U/mL DNase I工作液,室温孵育10 min。

(5)轻轻吸掉多余液体,PBS清洗样品2次。

  1. TUNEL 反应

(1)每个样本加入 100 μL TUNEL 平衡缓冲液,孵育 5 min。

(2)预先配制 TUNEL 反应混合液:每个样本需要已加入1 μL TdT 酶的 50 μL TUNEL 反应缓冲液。

(3)弃去平衡缓冲液,用滤纸小心吸去切片样本周围的多余液体,每个样本加入 50 μL TUNEL 反应混合液。

a.贴壁细胞,用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。37℃避光孵育 60 min。

b.悬浮细胞,可加入微孔板中,采用微孔板振荡器进行孵育或每隔 15 min 温和的震荡反应管,使之充分反应。37℃避光孵育 60 min。

c.组织样本,用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。将样本平放于湿盒内,37℃恒温箱孵育2 h,湿盒底部铺一张含少量水的纸巾保持湿度。37℃避光孵育 2 h。

d.去掉反应液,在1×PBS 的染色缸中浸泡润洗2次,每次5 min。再使用适量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100,其中含 5 mg/mL BSA 的缓冲液清洗样本3 次,每次5 min,以降低背景。

(5)(可选)复染:每个样本滴加浓度为2 μg/mL 的DAPI染液,避光室温孵育10 min。染色完后,轻轻去掉染液,并将样本在1×PBS中浸泡润洗3次,每次5 min。

(6)(可选)封片:将切片样本先纯水浸没5 min,再放入70%乙醇浸没5 min,再80%乙醇浸没5 min,90%乙醇浸没5 min,95%乙醇浸没5 min,无水乙醇浸没5 min,最后将切片样本置于染色缸中以新鲜的二甲苯浸泡透明化处理2次,每次5 min(通风厨中操作)。脱水完成后,擦去切片周围的液体,每个切片样本滴加50 μL抗荧光淬灭封片液,盖上盖玻片,用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片,去除气泡以使封片完全。

(7)用荧光显微镜或流式细胞仪观察、分析,Cy3的激发波长为550nm,发射波长为570nm(凋亡细胞应被标记上明亮的红色荧光,没有加入TdT 酶的阴性对照样本未被标记上荧光)。

注意事项

  1. 本产品仅限于科学实验研究使用,不得用于临床诊断、治疗等领域。
  2. 荧光染料均存在淬灭问题,保存和使用过程中请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
  3. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

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快速细胞冻存液(无血清、无蛋白)