Quick Cell PCR法支原体检测试剂盒

产品货号:

AC16L064

产品规格:

100T

产品价格:

1500

产品描述

Quick Cell PCR法支原体检测试剂盒,本试剂盒采用一对支原体特异性引物,用于对样品的支原体基因组DNA进行PCR扩增,然后通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。试剂盒内同时含有内参对照,用于监控PCR是否正常扩增。

本试剂盒是一种广谱的支原体检测试剂盒,可以识别所有100多种至今已发现的支原体;能用于检测一切可能含支原体的样品,比如:体外细胞培养的上清;血清;各种体液,如唾液、尿液、鼻腔分泌物等;其他液体样品等。具有100%支原体识别率、灵敏度极高、含内参条带从而可以区分真阴性样品和假阴性样品、无需配套相对昂贵的荧光定量PCR仪等优点。

经多次测试,本试剂盒有记录可以识别在体外细胞培养中曾经报道出现的20种支原体,根据文献报道,这些支原体基本能占污染细胞的支原体种类的100%。具体如下:(1)M. hyorhinis、(2)M. fermentans、(3)M. arginini、(4)M. hominis、(5)M. orale、(6)M. salivarium、(7)M.pirum、(8)A. laidlawii、(9)M. agalactiae、(10)M. bovis、(11)M. bovoculi、(12)A. axanthum、(13)M. buccale、(14)M. pneumoniae、(15)M. arthritidis、(16)M. pulmonis、(17)M. gallisepticum、(18)M. gallinarum、(19)M. canis、(20)Ureaplasma urealyticum(注:M.为Mycoplasma的缩写; A.为Acholeplasma的缩写)。

订购信息

产品名称

产品货号

规格

价格

Quick Cell PCR法支原体检测试剂盒

AC16L064

100T

1500

 产品组分

产品组分

规格

支原体引物和内参(100次)

206 μL

阳性支原体DNA

50 μL

去离子水

1.8 mL

(请使用普通蒸馏水或去离子水,不能使用去内毒素的水)

【注】:以下试剂需要自行准备:①普通的Taq DNA 聚合酶(推荐使用 Takara 品牌的Ex Taq Hot Start version,货号:RR006A,已包含2.5 mM 的 dNTP)和相应的缓冲液;② 2.5 mM的dNTP;③DNA上样缓冲液(推荐使用李记生物的GelRed预染DNA上样缓冲液(5X),货号:AN34L047,该缓冲液已含无毒核酸染料,不需要接触 EB 等致癌物质)。

运输与保存

蓝冰运输。-20℃保存,有效期60个月。

使用方法

1.待测样品的准备 

取换液后培养2-3 d且汇合度在90%左右的细胞培养液上清(贴壁细胞)。悬浮培养的细胞在换液传代后,生长2-3 d再取培养液进行检测。可以按照以下两种方法之一进行样品的前处理:

方法一

(1)取 150μL上述待测样品到1.5 mL离心管内,在普通台式离心机上1000 rpm 低速离心5 min;

(2)上述离心上清液,95 ℃加热处理5 min(可以转移到 PCR 管内,在 PCR 仪上进行加热处理),简单离心(1000g,5 s)后,取上清进行检测。

方法二(推荐本方法,有高速离心机的的可选用本方法,可以去PCR抑制物,准确性更高。)

(1)根据浓缩倍数,可以取100 – 1500μL上述待测样品到1.5 mL离心管内,普通台式离心机1000 rpm 离心5 min,将离心后的上清转移到另一个离心管内,丢弃细胞沉淀。

(2)将上清继续13000 rpm(约16000 g)高速离心5 min,小心吸走全部上清,用50μL 5 mM Tris-HCl,pH 8.5(推荐使用,样品可以长期保存)或者去离子水(样品比较不稳定,只适合当天或短期内检测使用)重悬、沉淀(沉淀中含有支原体),吹吸均匀。

(3)该重悬后的样品可以直接检测,也可以进行热处理后再检测(热处理后,样品保存更稳定)。热处理具体如下:95 ℃加热处理 5 min(可以转移到PCR管内,在PCR仪上进行加热处理),简单离心(1000g,5 s)后,取上清进行检测。

【注】:

① 这里的细胞培养上清不是指细胞经胰酶消化后的离心上清,而是指至少培养 2 d后的贴壁细胞培养液上清或悬浮细胞培养液;

② 本步骤的低速离心是为了去除哺乳动物细胞,以排除其不必要的干扰。所以离心力要严格控制在150-200 g,该离心力下,哺乳动物细胞将被沉淀下来而支原体不会;

③ 收集的待测细胞培养液样品如果不立即检测,请放于-20℃或-80℃冰箱保存;

④ 如果预期待测样品支原体含量较少(比如低温保存的血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液、生物制品、极个别细胞培养上清等),可以采取措施以提高检测的灵敏度,具体方法请看后文注意事项部分:如何提高本试剂盒检测灵敏度。

2.PCR 体系的配制  

(1)按照25μL体系配制比例如下。如果是多样品检测,加两个对照样品后各组分总体积如下表。配制好的混合液,按每管23μL分装到0.2 mL的PCR管中。

 

单个样品体积(μL)

样品总数

总体积(μL)

去离子水

16.375

N

16.375×(N+2)×1.06

Takara 10× Ex Taq buffer(含 Mg2+)

2.5

N

2.5×(N+2)×1.06

2.5 mM dNTP

2

N

2×(N+2).06

Takara 5 Units/μL Ex Taq Hot Start

0.125

N

0.125×(N+2)×1.06

支原体引物和内参

2

N

2×(N+2)×1.06

【注】:

① 总体积中多配制 6% 是为了防止移液导致误差,以保证每个反应管中的反应液足量;

② 如果有条件,PCR 体系的配制最好在冰上进行操作;

③ 本试剂盒不推荐使用 2× 的 PCR mixture(内含 Taq 酶、缓冲液和 dNTP),建议使用Taq酶、10×Taq 缓冲液和 dNTP 等试剂配制PCR体系;

④ 为了避免可能的污染,收到的支原体引物和内参,可以适当分装(比如:每支 40μL)后冷冻保存;

⑤ 如果使用的是其他 Taq 酶(前提是:阴性对照的 586 bp 内参条带必须有一定亮度,且稳定性良好,否则不能使用),酶、去离子水的加入量需要根据其说明书进行调整。

(2)加入待测样品、阴性和阳性对照样品。样品检测管中加入2μL待测样品,阴性对照管加入2μL去离子水,阳性对照管加入2μL阳性支原体 DNA。

【注】:

① 装有阳性支原体 DNA 的螺口管开盖之前,低速离心或用手指捏住,用力甩一下即可;

② 进行反应体系配制的房间,与样品前处理、加阳性对照DNA、样品DNA的房间最好分开。

 3.PCR 参数设置

1 cycle

94 ℃

2 min

 

40 cycles

 

94 ℃

15 sec

55 ℃

15 sec

72 ℃

45 sec

1 cycle

72 ℃

5 min

1 cycle

8 ℃

forever

 4.PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳 

配制含溴化乙锭(EB)的浓度为 1.5%的 DNA 琼脂糖凝胶(推荐使用李记生物的GelRed预染DNA上样缓冲液(5X),货号:AN34L047,该产品预添加了无毒安全染料);当溴酚蓝染料跑出上样孔 3-4 cm时,停止电泳,拍照。

5.结果判断  

PCR 扩增的结果有可能出现以下几种情况:

 

电泳结果

电泳结果

电泳结果

电泳结果

电泳结果

电泳结果

DNA Mark

586 bp 内参条带

++

+

++

++

 

270 bp 左右条带

++++

+++

++

+

 

结果图示(见图1)

泳道 1

泳道 2

泳道 3

泳道 4

泳道 5

泳道 6

泳道M

支原体污染判断

阴性

极重度污染

重度污染

中度污染

轻度污染

PCR被抑制

 

【注】:“-”代表没有条带;“+”代表有条带;“+”号越多代表条带越强。

支原体 PCR 扩增结果:586 bp 条带为内参条带,270 bp 左右的条带为支原体特异条带(各支原体的条带大小会略有不同,总体在 266-280 bp 之间。注意:支原体特异条带的大小不会超过该范围。超过该范围的,就是杂带!)。随着支原体 DNA 模板的增加,270 bp 左右的条带会逐渐增强而 586 bp 的内参条带会逐渐减弱,甚至消失。

泳道1:阴性对照或者没有支原体污染的样品;

泳道2:极重度支原体污染样品;

泳道3:重度污染样品;

泳道4:中度污染样品;

泳道5:轻度污染样品;

泳道6:PCR 的扩增被细胞的代谢产物抑制,导致扩增失败。

M:DNA marker.

注意事项

  1. 本产品主要用于细胞上清支原体污染检测,仅限于科学实验研究使用,不得用于临床诊断、治疗等领域。
  2. 设有阴性对照,保证本试剂盒含有的支原体引物和内参以及整个反应体系正常。
  3. 只有当阴性对照的结果没有出现 270 bp 左右的支原体特异条带时,其他样品的检测结果才是可信的。
  4. 每次试验阴性对照中 586 bp 的内参条带都必须出现而且要有一定的亮度,才说明试验成功。如果阴性对照的内参条带经常没有出现或者非常弱,说明试验不成功,这时可以采取以下几个措施: a.请使用普通蒸馏水或去离子水。不能使用去内毒素的水、DEPC 处理的水或者商品化的 DNase/RNase-free的水,这几种水都可能会抑制 PCR 扩增的效率。 b.请使用 Takara 公司的 Ex Taq Hot Start version(首选。货号: RR006A,可用 400 次)。 c.可以尝试增加 PCR 的循环数,比如:由原来的 40 个循环,增加到 45 个循环。如果采取以上几个措施后,阴性对照的内参条带仍然经常没有出现或者非常弱,请联系厂家解决。
  5. 如果直接使用细胞培养液上清进行检测,而检测结果显示该样品 586 bp 条带和 270 bp 左右的条带都没有出现(如图 1,泳道 6)或者内参条带非常微弱,在排除 PCR试剂的问题后,说明该样品含有抑制 PCR 扩增的代谢产物。
  6. 防 DNA 污染注意事项: a.强烈建议所有操作全部使用进口滤芯吸头(比如:Axygen 滤芯吸头)进行操作,以免试剂被污染。 b.“PCR 体系配制的房间、移液枪”(不要使用细胞培养室的移液枪!)和“PCR 产物的电泳房间、移液枪”一定要分开,不能在同一个房间进行,也不能使用相同的移液枪进行操作。 c.PCR 产物是导致假阳性的最主要原因,PCR 产物不要在 PCR 体系配制的房间中打开。 d.样品处理的房间和移液枪,如有条件,最好也分开。 e.收到的支原体引物和内参,可以分装(比如 40 μL一支)后保存。
  7. 如发现细胞被支原体污染,推荐使用李记生物的Quick Cell支原体祛除预防试剂盒,货号:AC16L066;以及EZ 水浴锅抑菌剂,货号:AC16L162和 EZ 细胞房除菌剂,货号:AC16L143。产品详情可咨询销售人员或见官网:http://life-ilab.com/
  8. 支原体检测样品可以分成两类:第一类,用含血清的培养液培养的哺乳动物细胞上清液,由于该条件非常适合支原体生长,培养数天后,支原体密度一般较高,可达 107-9/mL,可以直接检测。第二类,低温保存的血浆、血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液等样品,由于这些样品即使有支原体污染,支原体含量一般很少,直接使用快速支原体检测试剂盒进行检测,往往检测不出来。这些样品建议:(1)对样品的支原体进行离心浓缩处理;(2)使用支原体液体培养基(必须同时接种不含精氨酸和含精氨酸的两种支原体液体培养基)培养 3-7d后,再进行检测。具体方法请参考李记生物 Quick Cell 发光法支原体检测试剂盒,货号:AC16L062 说明书中最后的注意事项部分。该方法速度较慢,需要 3-7 d,但是可靠性高。

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Quick Cell PCR法支原体检测试剂盒

产品货号:

AC16L064

产品规格:

100T

产品价格:

1500

产品描述

Quick Cell PCR法支原体检测试剂盒,本试剂盒采用一对支原体特异性引物,用于对样品的支原体基因组DNA进行PCR扩增,然后通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。试剂盒内同时含有内参对照,用于监控PCR是否正常扩增。

本试剂盒是一种广谱的支原体检测试剂盒,可以识别所有100多种至今已发现的支原体;能用于检测一切可能含支原体的样品,比如:体外细胞培养的上清;血清;各种体液,如唾液、尿液、鼻腔分泌物等;其他液体样品等。具有100%支原体识别率、灵敏度极高、含内参条带从而可以区分真阴性样品和假阴性样品、无需配套相对昂贵的荧光定量PCR仪等优点。

经多次测试,本试剂盒有记录可以识别在体外细胞培养中曾经报道出现的20种支原体,根据文献报道,这些支原体基本能占污染细胞的支原体种类的100%。具体如下:(1)M. hyorhinis、(2)M. fermentans、(3)M. arginini、(4)M. hominis、(5)M. orale、(6)M. salivarium、(7)M.pirum、(8)A. laidlawii、(9)M. agalactiae、(10)M. bovis、(11)M. bovoculi、(12)A. axanthum、(13)M. buccale、(14)M. pneumoniae、(15)M. arthritidis、(16)M. pulmonis、(17)M. gallisepticum、(18)M. gallinarum、(19)M. canis、(20)Ureaplasma urealyticum(注:M.为Mycoplasma的缩写; A.为Acholeplasma的缩写)。

订购信息

产品名称

产品货号

规格

价格

Quick Cell PCR法支原体检测试剂盒

AC16L064

100T

1500

 产品组分

产品组分

规格

支原体引物和内参(100次)

206 μL

阳性支原体DNA

50 μL

去离子水

1.8 mL

(请使用普通蒸馏水或去离子水,不能使用去内毒素的水)

【注】:以下试剂需要自行准备:①普通的Taq DNA 聚合酶(推荐使用 Takara 品牌的Ex Taq Hot Start version,货号:RR006A,已包含2.5 mM 的 dNTP)和相应的缓冲液;② 2.5 mM的dNTP;③DNA上样缓冲液(推荐使用李记生物的GelRed预染DNA上样缓冲液(5X),货号:AN34L047,该缓冲液已含无毒核酸染料,不需要接触 EB 等致癌物质)。

运输与保存

蓝冰运输。-20℃保存,有效期60个月。

使用方法

1.待测样品的准备 

取换液后培养2-3 d且汇合度在90%左右的细胞培养液上清(贴壁细胞)。悬浮培养的细胞在换液传代后,生长2-3 d再取培养液进行检测。可以按照以下两种方法之一进行样品的前处理:

方法一

(1)取 150μL上述待测样品到1.5 mL离心管内,在普通台式离心机上1000 rpm 低速离心5 min;

(2)上述离心上清液,95 ℃加热处理5 min(可以转移到 PCR 管内,在 PCR 仪上进行加热处理),简单离心(1000g,5 s)后,取上清进行检测。

方法二(推荐本方法,有高速离心机的的可选用本方法,可以去PCR抑制物,准确性更高。)

(1)根据浓缩倍数,可以取100 – 1500μL上述待测样品到1.5 mL离心管内,普通台式离心机1000 rpm 离心5 min,将离心后的上清转移到另一个离心管内,丢弃细胞沉淀。

(2)将上清继续13000 rpm(约16000 g)高速离心5 min,小心吸走全部上清,用50μL 5 mM Tris-HCl,pH 8.5(推荐使用,样品可以长期保存)或者去离子水(样品比较不稳定,只适合当天或短期内检测使用)重悬、沉淀(沉淀中含有支原体),吹吸均匀。

(3)该重悬后的样品可以直接检测,也可以进行热处理后再检测(热处理后,样品保存更稳定)。热处理具体如下:95 ℃加热处理 5 min(可以转移到PCR管内,在PCR仪上进行加热处理),简单离心(1000g,5 s)后,取上清进行检测。

【注】:

① 这里的细胞培养上清不是指细胞经胰酶消化后的离心上清,而是指至少培养 2 d后的贴壁细胞培养液上清或悬浮细胞培养液;

② 本步骤的低速离心是为了去除哺乳动物细胞,以排除其不必要的干扰。所以离心力要严格控制在150-200 g,该离心力下,哺乳动物细胞将被沉淀下来而支原体不会;

③ 收集的待测细胞培养液样品如果不立即检测,请放于-20℃或-80℃冰箱保存;

④ 如果预期待测样品支原体含量较少(比如低温保存的血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液、生物制品、极个别细胞培养上清等),可以采取措施以提高检测的灵敏度,具体方法请看后文注意事项部分:如何提高本试剂盒检测灵敏度。

2.PCR 体系的配制  

(1)按照25μL体系配制比例如下。如果是多样品检测,加两个对照样品后各组分总体积如下表。配制好的混合液,按每管23μL分装到0.2 mL的PCR管中。

 

单个样品体积(μL)

样品总数

总体积(μL)

去离子水

16.375

N

16.375×(N+2)×1.06

Takara 10× Ex Taq buffer(含 Mg2+)

2.5

N

2.5×(N+2)×1.06

2.5 mM dNTP

2

N

2×(N+2).06

Takara 5 Units/μL Ex Taq Hot Start

0.125

N

0.125×(N+2)×1.06

支原体引物和内参

2

N

2×(N+2)×1.06

【注】:

① 总体积中多配制 6% 是为了防止移液导致误差,以保证每个反应管中的反应液足量;

② 如果有条件,PCR 体系的配制最好在冰上进行操作;

③ 本试剂盒不推荐使用 2× 的 PCR mixture(内含 Taq 酶、缓冲液和 dNTP),建议使用Taq酶、10×Taq 缓冲液和 dNTP 等试剂配制PCR体系;

④ 为了避免可能的污染,收到的支原体引物和内参,可以适当分装(比如:每支 40μL)后冷冻保存;

⑤ 如果使用的是其他 Taq 酶(前提是:阴性对照的 586 bp 内参条带必须有一定亮度,且稳定性良好,否则不能使用),酶、去离子水的加入量需要根据其说明书进行调整。

(2)加入待测样品、阴性和阳性对照样品。样品检测管中加入2μL待测样品,阴性对照管加入2μL去离子水,阳性对照管加入2μL阳性支原体 DNA。

【注】:

① 装有阳性支原体 DNA 的螺口管开盖之前,低速离心或用手指捏住,用力甩一下即可;

② 进行反应体系配制的房间,与样品前处理、加阳性对照DNA、样品DNA的房间最好分开。

 3.PCR 参数设置

1 cycle

94 ℃

2 min

 

40 cycles

 

94 ℃

15 sec

55 ℃

15 sec

72 ℃

45 sec

1 cycle

72 ℃

5 min

1 cycle

8 ℃

forever

 4.PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳 

配制含溴化乙锭(EB)的浓度为 1.5%的 DNA 琼脂糖凝胶(推荐使用李记生物的GelRed预染DNA上样缓冲液(5X),货号:AN34L047,该产品预添加了无毒安全染料);当溴酚蓝染料跑出上样孔 3-4 cm时,停止电泳,拍照。

5.结果判断  

PCR 扩增的结果有可能出现以下几种情况:

 

电泳结果

电泳结果

电泳结果

电泳结果

电泳结果

电泳结果

DNA Mark

586 bp 内参条带

++

+

++

++

 

270 bp 左右条带

++++

+++

++

+

 

结果图示(见图1)

泳道 1

泳道 2

泳道 3

泳道 4

泳道 5

泳道 6

泳道M

支原体污染判断

阴性

极重度污染

重度污染

中度污染

轻度污染

PCR被抑制

 

【注】:“-”代表没有条带;“+”代表有条带;“+”号越多代表条带越强。

支原体 PCR 扩增结果:586 bp 条带为内参条带,270 bp 左右的条带为支原体特异条带(各支原体的条带大小会略有不同,总体在 266-280 bp 之间。注意:支原体特异条带的大小不会超过该范围。超过该范围的,就是杂带!)。随着支原体 DNA 模板的增加,270 bp 左右的条带会逐渐增强而 586 bp 的内参条带会逐渐减弱,甚至消失。

泳道1:阴性对照或者没有支原体污染的样品;

泳道2:极重度支原体污染样品;

泳道3:重度污染样品;

泳道4:中度污染样品;

泳道5:轻度污染样品;

泳道6:PCR 的扩增被细胞的代谢产物抑制,导致扩增失败。

M:DNA marker.

注意事项

  1. 本产品主要用于细胞上清支原体污染检测,仅限于科学实验研究使用,不得用于临床诊断、治疗等领域。
  2. 设有阴性对照,保证本试剂盒含有的支原体引物和内参以及整个反应体系正常。
  3. 只有当阴性对照的结果没有出现 270 bp 左右的支原体特异条带时,其他样品的检测结果才是可信的。
  4. 每次试验阴性对照中 586 bp 的内参条带都必须出现而且要有一定的亮度,才说明试验成功。如果阴性对照的内参条带经常没有出现或者非常弱,说明试验不成功,这时可以采取以下几个措施: a.请使用普通蒸馏水或去离子水。不能使用去内毒素的水、DEPC 处理的水或者商品化的 DNase/RNase-free的水,这几种水都可能会抑制 PCR 扩增的效率。 b.请使用 Takara 公司的 Ex Taq Hot Start version(首选。货号: RR006A,可用 400 次)。 c.可以尝试增加 PCR 的循环数,比如:由原来的 40 个循环,增加到 45 个循环。如果采取以上几个措施后,阴性对照的内参条带仍然经常没有出现或者非常弱,请联系厂家解决。
  5. 如果直接使用细胞培养液上清进行检测,而检测结果显示该样品 586 bp 条带和 270 bp 左右的条带都没有出现(如图 1,泳道 6)或者内参条带非常微弱,在排除 PCR试剂的问题后,说明该样品含有抑制 PCR 扩增的代谢产物。
  6. 防 DNA 污染注意事项: a.强烈建议所有操作全部使用进口滤芯吸头(比如:Axygen 滤芯吸头)进行操作,以免试剂被污染。 b.“PCR 体系配制的房间、移液枪”(不要使用细胞培养室的移液枪!)和“PCR 产物的电泳房间、移液枪”一定要分开,不能在同一个房间进行,也不能使用相同的移液枪进行操作。 c.PCR 产物是导致假阳性的最主要原因,PCR 产物不要在 PCR 体系配制的房间中打开。 d.样品处理的房间和移液枪,如有条件,最好也分开。 e.收到的支原体引物和内参,可以分装(比如 40 μL一支)后保存。
  7. 如发现细胞被支原体污染,推荐使用李记生物的Quick Cell支原体祛除预防试剂盒,货号:AC16L066;以及EZ 水浴锅抑菌剂,货号:AC16L162和 EZ 细胞房除菌剂,货号:AC16L143。产品详情可咨询销售人员或见官网:http://life-ilab.com/
  8. 支原体检测样品可以分成两类:第一类,用含血清的培养液培养的哺乳动物细胞上清液,由于该条件非常适合支原体生长,培养数天后,支原体密度一般较高,可达 107-9/mL,可以直接检测。第二类,低温保存的血浆、血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液等样品,由于这些样品即使有支原体污染,支原体含量一般很少,直接使用快速支原体检测试剂盒进行检测,往往检测不出来。这些样品建议:(1)对样品的支原体进行离心浓缩处理;(2)使用支原体液体培养基(必须同时接种不含精氨酸和含精氨酸的两种支原体液体培养基)培养 3-7d后,再进行检测。具体方法请参考李记生物 Quick Cell 发光法支原体检测试剂盒,货号:AC16L062 说明书中最后的注意事项部分。该方法速度较慢,需要 3-7 d,但是可靠性高。

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