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细胞冻存是将细胞放在低温环境,减少细胞代谢,以便长期储存的一种技术,这样可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,以便需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞,可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件丢失细胞,起到了细胞保种的作用。

细胞冻存步骤

1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液;

2. 取对数生长期的细胞,去除旧培养液,用PBS清洗。

3. 去除PBS,加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来;

4. 离心1000rpm,5min;

5. 去除胰蛋白酶,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml;

6. 将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml;

7. 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者;

8. 冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。

细胞复苏步骤

1. 从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。

2. 从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀;

3. 离心, 1000rpm,5min;

4. 弃去上清液,加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养;

5. 次日更换一次培养液,继续培养。

细胞冻存液用途

1.无血清细胞冻存液用于造血干细胞、间充质干细胞等干细胞的储存。

2.无血清细胞冻存液用于T淋巴细胞、NK细胞等免疫细胞的存储。

3.无血清细胞冻存液用于其他类型哺乳动物细胞的储存。

细胞冻存注意事项

1.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存,但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液;

2.将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤;

3.冻存和复苏最好用新配制的培养液。