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EZ ECL pico化学发光液是一款高灵敏度的增强型化学发光(ECL)HRP底物,可帮助用户在免疫印迹分析过程中实现低于皮克级的蛋白检测(<1×1012g),极其节省抗体。EZ ECL pico底物可为使用辣根过氧化物酶(HRP)偶联物的免疫印迹实验提供明亮的信号和低皮克级检测灵敏度。该ECL底物能够兼容各种膜、封闭液和宽范围抗体稀释液,以出色性能、通用性和高性价比,满足用户的免疫印迹应用需求。
EZ ECL pico底物的特点:
• 灵敏度高:检测硝化纤维素膜或PVDF膜上低皮克级的蛋白条带。
• 长信号持续时间:在条件优化情况下,经底物孵育的印迹条带能够持续输出 6~8 h 的可检测光信号。
• 试剂稳定:试剂盒在室温下可稳定放置长达6个月,4℃条件下存放1年不影响使用。
建议稀释浓度:
• 一抗浓度:建议以1mg/mL储备液起1:1,000-1:5,000 或 0.2-1ug/mL
• 二抗浓度:建议以1mg/mL储备液起1:20,000-1:100,000或10-50ng/mL
产品组分
组分名称 A液 B液
AP34L024(100 mL) 50 mL 50 mL
AP34L025(500 mL) 250 mL 250 mL
运输与保存
蓝冰运输。4℃避光保存,有效期12个月。
使用方法
  1. 取出印记膜,加入合适的封闭液在温室下孵育20~60 min,同时振荡,以封闭膜上非特异性蛋白结合位点。

  2. 将膜从封闭液中取出,与一抗工作液在温室孵育1 h,同时振荡;或在28℃孵育过夜,不振荡。

  3. 将足量的洗涤缓冲液加至膜上,保证缓冲液将膜*覆盖。振荡孵育≥5 min,更换洗涤缓冲液并重复该步骤4~6次。增加洗涤缓冲液体积,洗涤次数和洗涤时间有助于降低背景信号。
    【注】:①孵育前,膜在洗涤缓冲液中的短暂淋洗会提高洗涤效率。②按前文建议的HRP标记二抗稀释度非常重要的。

  4. 将HRP标记的二抗工作液与膜在温室孵育1 h,同时振荡。

  5. 重复步骤3,以除去未结合的HRP标记二抗。【注】:膜与HRP标记二抗孵育后必须进行*洗涤。

  6. 将A溶液与B液等比例混合,制备成工作液。每cm2膜使用0.01~0.1 mL工作液,工作液可以在温室下稳定8 h。
    【注】:暴露于日光或其他强光下可能损害工作液,为获得最佳结果,请将此工作液保存在琥珀色瓶中光;实验室的常见照明不会损害工作液。

  7. 将印记膜在工作液中孵育5 min。从工作液中取出印记膜,并置于一个塑料片或清洁的塑料纸(膜)中,用一张吸水纸吸除多余的液体,并从印记和塑料纸之间小心地压出气泡。

  8. 将包在塑料纸(膜)中的印记膜置于胶片暗盒中,蛋白质面朝上,除适用于胶片曝光的灯(如红色安全灯)之外,关闭所有的灯。
    【注】:①胶片必须在曝光期间保持干燥;②确保将多余的底物从膜和塑料纸上*去除;③在整个胶片处理期间,使用手套。

  9. 将X光胶片置于膜的上面。建议第一次曝光60 s。之后可调整曝光时间以达到最佳结果。化学发光反应在底物孵育后的前5~30 min期间是强烈的。这一反应可以持续几个小时,但强度会随时间下降,如有底物孵育后较长时间后曝光,曝光时间可能需要延长以获得较强信号。如果使用磷光存储成像设备(如Bio-Rad的分子成像仪系统)或CCD照相机可能需要较长的曝光时间。
    【注】:胶片与膜之间的任何移动可能在胶片上造成人为的非特异信号。

  10. 使用合适的显影剂和定影剂对胶片进行显影。如果信号太强,则缩短曝光时间或将印记膜进行剥离并降低抗体浓度重新检测。

注意事项
  1. 本产品仅限于科学实验研究使用,不得用于临床诊断、治疗等领域。

  2. 为获得最佳效果,必须优化该系统的全部组分,包括样品量、一抗和二抗浓度以及膜和封闭试剂的类型。

  3. 使用本产品比使用沉淀比色HRP底物检测所需的抗体浓度低。为优化抗体浓度,请进行一次系统的点印迹分析。

  4. 没有一种封闭试剂对所有系统而言都是最佳的,所以为每一个免疫印迹检测系统找到最合适的封闭缓冲液非常必需。封闭试剂有可能与抗体产生交叉反应,导致出现非特异性信号。封闭缓冲液同时也会影响系统的灵敏性。当从一种底物转换为另一种底物时,有时会出现信号衰减或背景增加的现象,原因可能是封闭缓冲液不适合新的检测系统。

  5. 使用亲和素/生*素检测系统时,避免使用牛奶作为封闭试剂,因为牛奶中含有不定量的内源性生*素,会导致高背景信号。

  6. 保证洗涤缓冲液、封闭缓冲液、抗体溶液和底物工作液的使用体积,以确保在整个实验过程中印迹膜*被液体覆盖,避免膜变干。增大封闭缓冲液及洗涤缓冲液的使用量可以降低非特异性的信号。

  7. 为获得最佳效果,在孵育步骤请使用摇床。

  8. 将Tween20(终浓度0.05~0.1%)加入封闭缓冲液和稀释的抗体溶液,以降低非特异信号。使用高品质的产品,如去污剂。它保存在安瓿中,过氧化物和其他杂质含量很低。

  9. 不要使用diedanna作为缓冲液的防腐剂。diedanna是HRP的抑制。

  10. 避免手与膜直接接触,实验过程应戴手套或使用干净的镊子。

  11. 所有设备必须清洁且不沾染外来物质。金属器械(如剪刀)不得具有可见的锈迹。锈迹可能导致斑点形成和高背景。

  12. 底物工作液在室温下可稳定8 h。日光或任何其他强光下可能损害底物,为获得最佳结果,将底物工作液保存在琥珀色瓶中,并避免长期暴漏在任何强光下,短时间暴漏于实验室常规照明不会损害该工作液。