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原文链接：和元生物——疾病研究
基于对病毒载体的深入了解和研发，越来越多的科研人员开始借助病毒载体进行疾病研究。目前，病毒载体工具在不同组织器官中均有大量的应用，通过使用工具病毒载体，对疾病相关基因进行定向和组织特异性的改造和操控，已成为科研人员进行疾病研究与治疗的一种技术手段。
病毒载体的选择
不同病毒载体的大小迥异，意味着其内含基因容量存在巨大差异；免疫原性的不同，意味着其体内/体外应用的场景需要细微调整；表达时间和周期的不同，意味着我们需要根据研究需求进行相对应的选择。
表1 不同病毒的生物学特性比较
慢病毒 | 腺相关病毒 | 腺病毒 | 逆转录病毒 | |
包膜 | 有 | 无 | 有 | 有 |
颗粒直径 | 80-100 nm | 20-30 nm | 90-100nm | ~100nm |
基因组 | dsRNA | ssDNA | dsDNA | RNA |
基因组大小 | 9.75kb | 4.7kb | 36kb | ~5kb |
表达起始时间 | 48-72h | 72-96h | 24-48h | 48-72h |
表达持续时间 | > 2 months | > 6 months | < 1 month | > 2 months |
体内扩散能力 | 一般 | 强 | 强 | 一般 |
免疫原性 | 中等 | 极低 | 强 | 中等 |
滴度范围 | 108~109TU/mL | 1012-1013VG/mL | 1011-1012PFU/mL | 107~108TU/mL |
滴度检测方法 | qPCR整合DNA | qPCR非整合DNA | 抗原抗体免疫染色试剂盒 | qPCR整合DNA |
整合方式 | 随机高频整合 | 定向低频整合（rAAV不整合） | 非整合 | 随机整合 |
应用范围 | 体外细胞感染，gRNA文库筛选，体内 | 基于不同的血清型，体内广泛应用 | 嗜肝，快速表达或短期表达，血液、心脏，细胞系等 | 特异性只感染分裂期的细胞 |
重组腺相关病毒载体（rAAV），一直是体内研究的明星载体，除了其免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广、扩散能力强、体内表达基因时间长等优势外，还在于其种类多样性。
现在研究中常用的rAAV就是利用AAV2型基因组与不同的衣壳蛋白结合产生的混合体病毒载体，一般标记为rAAV2/N (N为不同的衣壳血清型)。重组的病毒具有AAV2型的稳定表达和基因整合能力，同时获得了不同血清型的组织感染嗜亲性，表现出一定的器官靶向特异性。
表2 不同血清型AAV的组织嗜亲性
血清型 | 组织亲和性 |
rAAV2/1 | 神经系统（高滴度顺向跨突触），肌肉，骨骼肌，心肌，平滑肌 |
rAAV2/2 | 神经系统，肌肉，肝脏，血管平滑肌，眼 |
rAAV2/3 | 肌肉，肝脏，肺，眼 |
rAAV2/4 | 神经系统，肌肉，眼，脑 |
rAAV2/5 | 神经系统，肺，视网膜，肝脏，滑膜关节 |
rAAV2/6 | 神经系统，肺，肌肉，心脏 |
rAAV2/7 | 肌肉，肝脏 |
rAAV2/8 | 神经系统，肝脏，胰腺，视网膜，脂肪组织 |
rAAV2/9 | 神经系统，心肌，肺，视网膜，皮肤，肌肉，脂肪组织 |
rAAV2-retro | 神经系统（逆向非跨突触） |
AAV-PHP.eB | 跨血脑屏障（静脉注射） |
AAV-PHP.S | 全外周神经（尾静脉注射） |
AAV-PAN | 胰腺（腹腔注射） |
AAV-LUNG | 肺（尾静脉注射） |
AAV-DJ | 视网膜，肺，肾脏，体外感染细胞 |
AAV-7m8 | 视网膜 |
AAV-ShH10Y | 视网膜Muller细胞 |
AAV-Rh10 | 肝脏，血液，心脏，体外感染细胞 |
AAV-Anc80L65 | 内耳、视网膜、骨骼肌、肝脏 |
AAV-SCH9 | SVZ区神经干细胞 |
小建议：如您不确定选择哪种血清型，可尝试使用和元生物Pandora’s Virus （AAV试用装）进行预实验，通过比较不同血清型对目标组织的感染效果，摸索最佳实验条件（注射方法、注射位点、病毒用量等），以便得到更理想的实验结果。（链接到Pandora’s Virus＞＞）
肝脏
肝脏是调控机体脂质代谢、血糖代谢的重要器官，其功能异常会导致脂肪肝、高胆固醇血症、高血脂症、糖尿病等疾病。
1、注射方式
应用病毒载体感染肝脏一般采用尾静脉注射的方式。
按照和元生物多年的经验，使用AAV载体感染肝脏组织一般选取AAV2/8血清型，通过尾静脉注射手段感染肝脏每只小鼠需要注射1x1010总滴度的病毒载体。
和元生物AAV感染结果
2、应用案例
2.1 肝脏特异启动子TGB
客户发表文章：FASEB Journal. (IF=5.391). Yang Y,et.al. (2018). Long-term exercise prevents hepatic steatosis: a novel role of FABP1 in regulation of autophagy-lysosomal machinery. [非酒精性脂肪肝，自噬溶酶体，腺相关病毒过表达]
注射方式：小鼠尾静脉注射
载体：AAV8-TGB-Fabp1
血清型：rAAV2/8
注射量：200ul，2× 1011 VG
观察时间：1周
2.2 Cre-loxp技术在小鼠肝脏中的应用
由于腺病毒高度嗜肝，几乎90%以上会感染肝脏，因此腺病毒可以作为肝脏特异性感染的有效载体。将Cre腺病毒（Ad-Cre）通过尾静脉注射入带有loxp小鼠体内，即可实现肝脏特异性表达并将目的基因敲除，从而快速获取肝脏特异性基因敲除小鼠。
2.3 CRISPR/Cas9技术在小鼠肝脏中的应用
通过腺病毒将CRISPR/Cas9系统相关元件（Cas9和sgRNA）注射入小鼠体内，可以实现在肝脏中特异性表达，并实现肝脏部位的特异性敲除。此方法比较适合检验活体实验。
胰腺
胰腺是一个兼有内、外分泌功能的器官，与机体消化、血糖代谢、脂质代谢等有密切的关系，也是代谢研究的关键目标器官之一。
在实际研究中，使用病毒载体感染胰腺主要有两种方式，一种是使用AAV2/8病毒载体，通过胆管将病毒注射入胰腺；另一种新方法是使用和元生物新研发的AAV-PAN病毒载体，腹腔注射感染胰腺：
和元生物AAV-PAN感染结果
心脏
1、注射方式
AAV的注射方式，不同的文章中采用了不一样的注射方式。总体上，一般包括静脉注射、心腔内注射、心肌内定点注射、心包内注射（介于心肌与心包膜之间），其中静脉注射包括尾静脉注射、颈静脉注射、面部静脉注射等。
尾静脉注射和心腔内注射由于病毒流进血液循环，分布较均匀。心腔内注射需要结合主动脉嵌夹进行，由于开胸腔手术需要辅助呼吸，对手术操作要求较高。心肌内定点注射时每点注射2-5ul，效果是在注射的局部点附近表达较高，但扩散非常有限。总的来说，很多实验直接用尾静脉注射即可，但是可能需要较高剂量的病毒，如果用心肌内定点注射，即小量多点注射，可以达到很好的感染表达效果，但是后者操作技术难度略高，也需要花费更长的操作时间。
结合新生鼠（出生2-10天）注射效果比较来看，新生鼠注射表达效果大大优于成年鼠，消耗病毒剂量也相对较低。新生鼠的注射，一般根据实验室的条件来看，可以选择颈静脉注射、面部静脉注射和心腔内（左心室）注射，目的是将病毒导入血液循环中。
2、启动子选择
一些常用启动子如CMV、CAG、αMHC、cTnC等常被用于驱动在心脏组织中的表达。很多高效的启动子由于片段较大，如αMHC，仅用于转基因小鼠等实验，不适合装载在AAV载体上。通过查阅文献，我们发现一些小的启动子如CMV在心脏组织的表达能力比较强，特别对于大片段的驱动效果很明显，但是如果需要介导的目的基因在心脏中特异性表达，则推荐使用cTnT启动子，cTnT常被用于心肌的特异性表达，表达能力也很强。
3、应用案例
3.1 心脏特异性启动子cTNT
客户发表文章：Yue Z, et al., (2019) PDGFR-b Signaling Regulates Cardiomyocyte Proliferation and Myocardial Regeneration. Cell Rep.
注射方式：
载体：AAV9
血清型：rAAV2/9
启动子：cTnT
注射量：200ul，2× 1011 VG
观察时间：1周
3.2 Cas9心脏特异性转基因小鼠
科学家构建了带有eSpCas9（1.1）的心脏特异性转基因小鼠，通过Myh6基因的启动子（αMHC）驱动Cas9在心肌的特异性表达。αMHC启动子是心脏特异性转基因小鼠常用启动子。这个工具小鼠能够解决实验过程中Cas9在心脏递送和表达的难题。转基因小鼠可以维持Cas9在心脏长期高水平的表达，而这个正是CRISPR/Cas9系统在心脏部位编辑效率不高的症结所在。
Cas9转基因小鼠，只需要通过AAV递送sgRNA到心脏表达即可实现，这种方法可以获得比较高的编辑效率。研究人员将靶向Myh6基因外显子sgRNA通过装载在AAV载体上注射入小鼠，实现心脏特异性敲除。Myh6表达水平降低50%以上，同时成功得到发生心肌肥厚和扩张型心脏的突变小鼠。
肺部
目前对于肺部的病毒感染，普遍采用AAV病毒载体，使用病毒载体感染胰腺主要有两种方式，一种是使用AAV2/9病毒载体，通过鼻内或气管内递送（经呼吸道）将病毒通过肺呼吸道递送，参考剂量是1×1011VG病毒，体积50ul；另一种新方法是使用和元生物新研发的AAV-LUNG病毒载体，尾静脉注射特异性感染肺部：
和元AAV-LUNG感染肺部结果
肌肉
目前，对于肌肉组织中使用的病毒载体通常会选用AAV病毒载体，因为AAV不仅能够高效特异地靶向肌肉组织，且能在肌肉组织中表达持久。腺病毒使用时容易引起较强的免疫反应，并且很容易被清除，表达时间比较短暂，较少被应用于肌肉组织的靶向表达。尽管慢病毒感染表达范围广泛，对培养的肌肉细胞均能高效表达，但是对肌肉组织的感染表达非常有限。目前靶向肌肉的AAV载体血清型主要为AAV1，AAV6和AAV9。其中，AAV9的表达效率最高，并且更容易在肌肉中高表达。
1、注射方式
应用病毒载体感染肌肉组织进行研究，一般分为系统注射和肌肉内注射，系统注射表达较均匀，但是大部分病毒会被其他脏器组织吸收，导致靶向肌肉的病毒较少。肌肉内注射是一种定点注射，可以在注射点附近高效表达，但缺点是病毒扩散十分有限，因此往往需要多点注射，一般每个点在5-10ul。
2、应用案例
注射方式：静脉注射
载体：AAV-CMV-miniDystrophin
血清型：rAAV2/9
观察时间：16周
脂肪组织
脂肪组织由大量脂肪细胞组成，分为白色脂肪、棕色脂肪和米色脂肪组织，脂肪组织是机体冗余能量储存的重要器官，同时也是重要的分泌器官，在机体的血糖代谢、脂质代谢、慢性炎症、伤疤修复等中有重要的生理功能。
研究中，如果我们使用病毒载体感染脂肪组织，一般采用定点注射的方式。使用AAV病毒载体感染脂肪组织一般选取rAAV2/8血清型，在脂肪组织的多点注射中，每个点注射量大约1x1010总滴度的病毒载体。
AAV感染脂肪
