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基因过表达

原文链接:和元生物——基因过表达

基因功能研究中通常需要上调目的基因的表达来观察表型的变化。过表达是将目的基因在宿主细胞大量表达的过程,其基本原理是将目的基因构建到工具载体上,导入细胞使基因实现大量转录和翻译,从而实现基因产物的过表达。工具载体通常包括原核表达载体、普通真核表达载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体等。

工具载体介绍

根据实验需要不同,目的基因大小等选择不同的载体,包括真核表达载体和病毒载体等均可以实现编码基因和非编码基因的过表达。

表达系统

真核表达载体

慢病毒载体

重组腺相关病毒载体

重组腺病毒载体

载体基因特性

双链DNA质粒

RNA逆转录病毒

单链DNA病毒

双链DNA病毒

外源基因表达时间

24h开始表达,持续3-7天

2-4天开始表达,长时间稳定表达

7-14天开始表达

1-2天开始表达

插入片段大小

8kb左右

4kb左右

2.8kb左右

4kb左右

稳定细胞株筛选

难操作

可以

不可以

不可以,瞬时表达

细胞实验

细胞系,部分转染效率低

首选,广谱,感染效率高

细胞系,部分血清型转染效率低

广谱,感染效率高

动物实验

不适合

适合,根据观察时间和注射部位

首选,根据观察时间和注射部位

免疫原性高,慎选

滴度范围

108~109TU/ml

1012-1013VG/ml

1010-1011PFU/ml

载体图谱中常见元件介绍

元件名称类型用途

启动子

CMV、CAG、EF1a、U6等

广谱或特异启动目的基因的表达

hSyn、CaMKIIα等

特异性启动子,在特定的组织细胞中启动目的基因的表达

蛋白标签

3xFLAG、HA 、6xHis、Myc等

与目的基因融合表达,常用于检测外源蛋白表达水平

荧光标记

EGFP、mCherry、mNeonGreen等

可与目的基因融合或非融合表达用于检测转染、感染效果

抗性基因

Puro、Neo、Hygro、BSD等

真核抗性,常用于稳定株筛选

Amp、Kan

原核抗性,常用于原核细菌培养,质粒扩增

连接元件

Linker

用于连接两个基因,融合表达时常用,可降低因融合表达对蛋白折叠和功能的影响

IRES、2A

用于连接两个基因,达到非融合表达的效果

其它元件

WPRE

增加目的基因的表达

载体选择(部分)

病毒载体的选择,根据实验的需求参考慢病毒、腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒等。

载体类别编号体元件

慢病毒过表达

GL127

pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-WPRE

GL121

pSLenti-EF1-EGFP-CMV-MCS-WPRE

GL107

pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE

GL122

pSLenti-EF1-EGFP-F2A-BSR-CMV-MCS-WPRE

GL124

pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE

腺病毒过表达

H225 

pADV-mCMV-MCS-3xFLAG

H201

pADV-mCMV-EGFP-3xFLAG

H213

pADV-mCMV-3xFLAG-EGFP

H204

pADV-mCMV-mCherry-HA

腺相关病毒过表达

AOV024

pAAV-CMV-EGFP-P2A-3xFLAG-WPRE

AOV025

pAAV-CMV-mCherry-P2A-3xFLAG-WPRE

AOV064

pAAV-hSyn-EGFP-P2A-3xFLAG-WPRE

AOV065

AAV-hSyn-mCherry-P2A-3xFLAG-WPRE

H9429

pAAV-CAG-EGFP-3xFLAG-tWPA

H9525

pAAV-CMV-EGFP-3xFLAG-tWPA

H10881

pAAV-CAG-EGFP-3xFLAG-tWPA

H10886

pAAV-CMV-EGFP-3xFLAG-tWPA

服务简介

根据客户提供的基因信息,从生物信息学网站上调出该基因的cDNA序列,将cDNA序列构建到工具载体中,根据实验需求过表达编码基因或者非编码基因。针对病毒载体,包装生产的病毒颗粒可以直接用于感染细胞或者动物实验。

病毒载体服务流程

微信截图_20240315093309.png

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