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CRISPR/Cas9

原文链接:和元生物——CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 是一种能够对基因组的特定位点进行精确编辑的技术。其原理是核酸内切酶Cas9蛋白通过导向性RNA(guide RNA, gRNA)识别特定基因组位点并对双链DNA进行切割,造成DNA双链断裂,细胞利用非同源末端连接(Non homologous End Joining,NHEJ)或者同源重组(Homologous Recombination, HR)方式对切割位点进行修复,实现DNA水平基因敲除或精确编辑。

CRISPR/Cas9系统主要由两部分组成:

1. 单链的guide RNA(single-guide RNA,sgRNA)
2. 有核酸内切酶活性的Cas9 蛋白

CRISPR基因敲除

以基因敲除为目的时,可以利用Cas9-sgRNA对DNA进行切割产生双链断裂,随后细胞通过非同源末端连接方式修复DNA,在此过程中,将随机引入碱基的缺失或增加,基因发生移码突变,导致编码基因的敲除。  

CRISPR基因编辑  

以基因敲入或替换为目的时,需要借助同源重组原理。CRISPR/Cas9系统中的Cas9-sgRNA在靶位点进行切割产生DNA双链断裂,在模板DNA存在时,细胞通过同源重组方式修复DNA,而模板DNA可以被人为设计成需要插入的基因或需要修复的基因,此时细胞编码目的基因。

载体的选择(部分)

提供病毒载体的含Cas9蛋白的单载和双载系统,可根据目的基因序列设计多条gRNA,载体带有多种荧光抗性标记,方便筛选。

载体类别

编号

载体元件

CRISPR慢病毒单载体

H5070

pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE

H7072

pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-BSR-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE

H6825

pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-sfGFP-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE

CRISPR慢病毒双载体

H5068

pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPRE

H5450

pLenti-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-espCas9_1.1-WPRE

CRISPR  AAV单载体系统

H6941

pAAV-CMV-SaCas9-U6-sagRNA v2.0

H5273

pAAV-hSyn-SaCas9-U6-sagRNA v2.0

CRISPR  AAV双载体系统

H6291

pAAV-CMV-EGFP-WPRE-U6-spgRNA v2.0

H12663

pAAV-U6-shRNA/spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPRE

H11012

pAAV-CMV-Luc2-WPRE-U6-spgRNA

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