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慢病毒载体

原文链接:和元生物——慢病毒载体

慢病毒载体(Lentivirus)是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体,是逆转录病毒的一种,基因组是RNA,其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒可将外源基因整合到基因组中实现稳定表达,具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。

慢病毒基因组进入细胞后,在细胞浆中反转录为DNA,形成DNA整合前复合体,进入细胞核后,DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA,回到细胞浆中,表达目的蛋白或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定,并随细胞基因组的分裂而分裂(图1)。

微信截图_20240410110410.png

  图1 慢病毒包装和侵染细胞的过程

  慢病毒载体具有宿主范围广,免疫原性低,基因容量大,可以长期表达等特点。能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。

  慢病毒的感染具有整合特性,能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上,达到持久性表达,因而可构建稳定细胞株,用于基因的细胞功能研究。借助慢病毒载体改造T细胞可用于CAR-T细胞治疗。

慢病毒包装与纯化

  慢病毒包装采用三质粒或四质粒系统进行包装,收集细胞培养上清,通过超速离心浓缩纯化和收集病毒。

慢病毒滴度检测

  检测方法:定量PCR检测感染后细胞基因组中外源DNA拷贝数

  实验原理:慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组

慢病毒载体优势

① 表达时间长:慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组上,实现基因长时间稳定的表达,不随细胞分裂传代而丢失,是细胞实验的首选,常用于构建稳定株。
② 安全性高:未发现致病性,慢病毒载体改造T细胞用于CAR-T细胞治疗。
③ 免疫原性低:直接注射活体组织不易造成免疫反应,适用于动物实验。

不同病毒的生物学特性比较

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载体选择


  和元生物拥有丰富的慢病毒产品,用于操作编码基因和非编码基因,如lncRNA、microRNA、circRNA,如下慢病毒载体可供您选择(不限于此列表):

调控方式

载体编号

载体名称(载体元件顺序)

真核抗性

荧光

启动子

默认标签

载体容量

   过表达

GL127

pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-WPRE

N/A

EGFP

CMV

3FLAG

4.8kb

GL121

pSLenti-EF1-EGFP-CMV-MCS-WPRE

N/A

EGFP

CMV

N/A

4.4kb

GL129

pSLenti-CMV-mCherry-3xFLAG-WPRE

N/A

mCherry

CMV

3FLAG

4.8kb

GL119

pSLenti-CMV-MCS-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE

Puro

N/A

CMV

3FLAG

4.4kb

GL120

pSLenti-SFH-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE

Puro

EGFP

CMV

3FLAG

3.5kb

GL107

pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE

Puro

EGFP

CMV

3FLAG

3.7kb

GL109

pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE

Puro

EGFP

CMV

N/A

3.8kb

GL122

pSLenti-EF1-EGFP-F2A-BSR-CMV-MCS-WPRE

blasticidin

EGFP

CMV

N/A

3.9kb

GL130

pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE

Puro

EGFP

CMV

3FLAG

3.7kb

GL132

pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-WPRE2-CMV-MCS

Puro

EGFP

CMV

N/A

3.7kb

GL123

pSLenti-EF1-mCherry-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE

Puro

mCherry

CMV

3FLAG

3.7kb

GL125

pSLenti-CMV-mCherry-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE

Puro

mCherry

CMV

3FLAG

3.7kb

GL133

pSLenti-EF1-mCherry-F2A-Puro-WPRE2-CMV-MCS

Puro

mCherry

CMV

N/A

3.7kb

H114

pLenti-CMV-Luc2-IRES-Puro-WPRE

Puro

N/A

CMV

N/A

2.2kb

GL124

pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE

Puro

N/A

CMV

N/A

2.8kb

 表达cre

H126

pLenti-CMV-NLS-Cre-3xFLAG-WPRE

N/A

N/A

CMV

3FLAG

3.9kb

H15108

pLenti-CMV-DIO-MCS-WPRE

N/A

N/A

CMV

3FLAG

5.3kb

三标

H7656

pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-mNeonGreen-F2A-Puro-WPRE

Puro

mNeonGreen

CBh

3FLAG

1.3kb

H7657

pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-tdTomato-F2A-Puro-WPRE

Puro

tdTomato

CBh

3FLAG

0.6kb

H9911

pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-mNeonGreen-F2A-BSR-WPRE

blasticidin

mNeonGreen

CBh

3FLAG

1.5kb

H9912

pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-tdTomato-F2A-BSR-WPRE

blasticidin

tdTomato

CBh

3FLAG

0.8kb

circRNA过表达

H8384

pLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-S-circRNA-WPRE

N/A

EGFP

CMV

N/A

3.0kb

H8807

pLenti-CMV-S-circRNA-WPRE

N/A

N/A

CMV

N/A

4.8kb

H8399

pLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-L-circRNA-WPRE

Puro

EGFP

CMV

N/A

1.0kb

H8810

pLenti-CMV-L-circRNA-WPRE

N/A

N/A

CMV

N/A

2.8kb

miRNA过表达

GL109

pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE

Puro

EGFP

CMV

N/A

N/A

H3919

pCLenti-U6-miR30(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE

Puro

EGFP

U6

N/A

N/A

H119

pLenti-CMV-TurboGFP-IRES-Puro-miR30(miRNA)-WPRE

Puro

TurboGFP

CMV

N/A

N/A

H3928

pCLenti-U6-miR30(miRNA)-CMV-mCherry-F2A-Puro-WPRE

Puro

mCherry

U6

N/A

N/A

H146

pCLenti-EF1-Puro-CMV-EGFP-3xFLAG-Sponge(miRNA)-WPRE

Puro

EGFP

CMV

3FLAG

N/A

H7505

pCLenti-U6-TuD(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-BSR-WPRE

blasticidin

EGFP

CMV

N/A

N/A

H7506

pCLenti-U6-TuD(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE

Puro

EGFP

CMV

N/A

N/A

过表达(Tet-on)

H125

pLenti-TRE-EGFP-EF1-rtTA3-IRES-Puro-WPRE

Puro

EGFP

TRE

N/A

2.0kb

H121

pLenti-TRE-EGFP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE

Puro

EGFP

TRE

3FLAG

3.3kb

H2057

pLenti-EF1-rtTA3-IRES-Puro-WPRE

Puro

N/A

EF1

N/A

N/A

shRNA干扰

GL401

pCLenti-U6-shRNA-CMV-Puro-WPRE

Puro

N/A

U6

N/A

N/A

GL404

pCLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-WPRE

N/A

EGFP

U6

N/A

N/A

GL427

pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE

Puro

EGFP

U6

N/A

N/A

GL428

pSLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-Puro-WPRE

Puro

mCherry

U6

N/A

N/A

H7615

pCLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-BSR-WPRE

blasticidin

mCherry

U7

N/A

N/A

CRISPR敲除

H5070

pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE

Puro

N/A

U6

N/A

N/A

H7072

pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-BSR-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE

blasticidin

N/A

U6

N/A

N/A

H6825

pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-sfGFP-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE

N/A

sfGFP

U6

N/A

N/A

H5068

pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPRE

N/A

EGFP

U7

N/A

N/A

H5450

pLenti-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-espCas9_1.1-WPRE

Puro

N/A

CMV

3FLAG

N/A

CRISPRa转录激活

H9517

pCLenti-U6-gRNA-MS2-EFS-dCas9-VP64-T2A-BSD-WPRE

blasticidin

N/A

U6

N/A

N/A

E2577

pCLenti-EF1a-MCP-P65-HSF1-T2A-Hygro-WPRE

hygromycin

N/A

EF1a

N/A

N/A

H7281

pLenti-CMV-dCas9-VP64-T2A-Puro-WPRE

Puro

N/A

CMV

N/A

N/A

常规应用

  体外感染细胞 

  慢病毒载体能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型原代细胞和大部分细胞系。 

  慢病毒的感染具有整合特性,能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上,因而可以达到持久性表达,从而构建稳转细胞株,体外进行细胞功能学实验,包括细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡等研究。稳定表达目的基因的肿瘤细胞株还可以进一步构建肿瘤动物模型,进行体内基因功能验证,药效药代,活体成像等检测,进一步研究体内肿瘤发生、发展和转移及药物治疗的效果。

  常见MOI列表

细胞名

中文名称

慢病毒感染MOI
(参考值)

MGC80-3

人胃癌细胞

10

HT-29

人结肠癌细胞

20

RKO

人结肠腺癌细胞

10

Caki-1

人肾透明细胞癌皮肤转移细胞

10

5637

人膀胱癌细胞

10

U-118 MG

人脑星形胶质母细胞瘤

10

RWPE-1

人正常前列腺上皮细胞

20

HeLa

人宫颈癌细胞

10~20

Ca Ski

人宫颈癌肠转移细胞

10

MCF7 [MCF-7]

人乳腺癌细胞

10

A549

人非小细胞肺癌细胞

10

NCI-H1299

人非小细胞肺癌细胞

20

U-87 MG

人脑星形胶质母细胞瘤

10

U251

人胶质瘤细胞

10

A172

人胶质母细胞瘤细胞

10

K-562

人慢性髓原白血病细胞

10

HL-60

人原髓细胞白血病细胞

10

GES-1

人胃上皮细胞

20

U266

人骨髓瘤细胞

20

CAL 27

人舌鳞癌细胞

20

PC9

人肺癌细胞

5

PC14

人肺癌细胞

10

MADB-106

大鼠乳腺癌细胞

20

F98

大鼠脑胶质瘤细胞

20

MHCC-97H

人肝癌细胞(高转移)

10~20

  MOI 是multiplicity of infection 的缩写,即感染复数,其含义是感染时病毒与细胞的数量比值,一般以实验中某个细胞,感染达到80%,定义为这个细胞的MOI值,即病毒量与细胞数的比值;加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000

慢病毒在肿瘤研究中的应用案例
1.Nature Communications. (IF=12.353). Shi Y,et.al. (2017). Tumour-associated macrophages secrete pleiotrophin to promote PTPRZ1 signalling in glioblastoma stem cells for tumour growth.[慢病毒, 胶质细胞瘤]
慢病毒干扰: Lenti-shNT/shPTN/shPTPRZ1

fb5c81ed3a220004b71069645f11286766027abe163d8.png

2. Hepatology. (IF=14.079). Ma JZ,et.al. (2016). METTL14 suppresses the metastatic potential of HCC by modulating m6 A-dependent primary miRNA processing. [慢病毒, 肝癌]
慢病毒过表达/干扰:pLV-CMV-PGK-EGFP-T2A-puro/ pLV-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-puro

10fb15c77258a991b0028080a64fb42d66027ac6caaa0.png

慢病毒在神经系统的应用(在体注射)

1.Nature Neuroscience. (IF=19.912). Ding XL,et.al. (2017). Activity-induced histone modifications govern Neurexin-1 mRNA splicing and memory preservation. [慢病毒, 学习与记忆]

09dd8c2662b96ce14928333f055c558066027acc86f6e.png

病毒类型:慢病毒
载体名称:LV-Suv39h1-RNAi(不确定详细的)
注射部位:海马DG区
病毒注射量:2 μL,9.98 × 108 TU/mL
检测时间:2周
2.Nature Communications. (IF=12.353). Yao XH,et.al. (2016). Electrical coupling regulates layer 1 interneuron microcircuit formation in the neocortex. [慢病毒, 神经环路]

8266e4bfeda1bd42d8f9794eb4ea0a1366027ad37f155.png

病毒类型:慢病毒
载体名称:LV- CX36-shRNA-EGFP(不确定详细的)
注射部位:P1小鼠新皮层L1
病毒注射量:1μL
检测时间:2周
3.Molecular Psychiatry. (IF=11.64). Guo DJ,et.al. (2019). Autism-like social deficit generated by Dock4 deficiency is rescued by restoration of Rac1 activity and NMDA receptor function. [慢病毒, 自闭症]

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病毒类型:慢病毒
载体名称:Lenti-CMV-EGFP-P2A-3FLAG-Rac1
注射部位:小鼠海马CA1区
病毒注射量:1μL
检测时间:4周
慢病毒延伸服务

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 和元生物慢病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程,采用三质粒或四质粒系统在293T细胞中进行包装。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化,并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。一般情况下我们的慢病毒的滴度在108~109TU/ml,完全可以满足各类实验的使用要求。

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