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双荧光素酶报告基因检测试剂盒实验原理与应用方向(双荧光素酶活动)

发布时间:2024-06-24
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— 实验原理 —

萤火虫荧光素酶是一种分子量约为61KD的蛋白,在ATP、镁离子和氧气存在的条件下,可以催化Luciferin 氧化成Oxyluciferin,在Luciferin 氧化的过程中,会发出生物荧光。

图1.萤火虫荧光素酶催化反应原理

海肾荧光素酶是一种分子量约为36KD的蛋白,在氧气存在的条件下,可以催化Coelenterazine 氧化成Coelenteramide,在Coelenterazine 氧化的过程中也会发出生物荧光。

图2.海肾荧光素酶催化反应原理

双荧光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶,萤火虫荧光素酶作为报告基因反应目的基因表达的改变,海肾萤光素酶作为内参基因,提供转录效率的对照(减少内在变化因素如培养细胞的数目,细胞转染和裂解的效率对实验准确性的影响)。两种荧光素酶没有种属同源性并对应不同的反应底物,故而没有交叉干扰。

— 应用方向 —

一、靶基因验证

miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用(降解或抑制翻译),将目的基因3’UTR(野生型和结合位点突变型)序列构建至载体中报告基因Luc的3’端,通过比较过表达miRNA后,报告基因表达的改变(萤光素酶的活性下降还是不变),明确miRNA的作用及miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

图3.靶基因验证实验设计原理


相关实验适用类型:miRNA-靶基因(mRNA、LncRNA、circRNA)、m6A位点、增强子

二、启动子活性验证

转录因子主要通过作用于靶基因的启动子起作用,将目的基因启动子区序列构建在报告基因Luc的5’端,通过共表达转录因子后,根据报告基因表达的改变,来确定转录因子与靶基因启动子结合位点及对靶基因的作用。

图4.启动子验证实验设计原理


— 应用示例 —

1、示例一

文章标题:METTL14/miR-29c-3p axis drives aerobic glycolysis to promote triple-negative breast cancer progression though TRIM9-mediated PKM2 ubiquitination

发表期刊:Journal of cellular and molecular medicine

和元助力:将WT TRIM9-3’UTR 和突变型 TRIM9-3‘UTR 构建至pMIR-REPORT载体,通过共转染miR-29c-3p mimics, miR-29c-3p inhibitor和 miRNA-NC,明确了miR-29c-3p与TRIM9的结合。

2、示例二

文章标题:The ELAVL3/MYCN positive feedback loop provides a therapeutic target for neuroendocrine prostate cancer

发表期刊:Nature communications

和元助力:为了阐明MYCN转录调控的分子机制,作者分别将ELAVL3的全长以及Segments A, B, C的启动子构建到luciferase报告基因载体上。通过双荧光素酶报告基因实验,发现MYCN显著上调full-length ELAVL3和ELAVL3 Segment A两组的luciferase信号,证明了MYCN对 ELAVL3的转录调控。

3、示例三

文章标题:METTL3 facilitates stemness properties and tumorigenicity of cancer stem cells in hepatocellular carcinoma through the SOCS3/JAK2/STAT3 signaling pathway

发表期刊:Cancer gene therapy

和元助力:SOCS3的CDS区,包含m6A识别位点野生型(GGACU)以及突变型(CCTGA),被构建在pMIR-REPORT载体上。通过过表达和干扰METTL3的表达,同时利用双荧光素酶报告基因实验证实了METTL3和SOCS3的相互作用。

/ 双荧光素酶活动 /

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