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活性氧ROS检测原理及检测步骤
ROS也叫活性氧（reactive oxygen species）是细胞内产生的一种具有氧化活性的化学物质，包括过氧化氢、超氧阴离子等。ROS在正常生理条件下也会产生，但当其产生过多或清除不足时，会对细胞造成氧化应激，导致细胞损伤和疾病发生。
检测原理
用于检测细胞内ROS最广泛采用的方法是DCFH-DA荧光探针法。DCFH-DA（二氯荧光黄双乙酸盐）是一种可指示的探针，其本身不具有荧光，但可以自由穿过细胞膜。一旦进入细胞，它会被细胞内的酯酶水解成DCFH。由于DCFH无法穿过细胞膜，因此荧光探针会在细胞内积聚。细胞内的ROS能够氧化无荧光的DCFH，生成有荧光的DCF，且荧光强度与ROS水平成正比。通过荧光显微镜、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等设备，在最大激发波长480nm和最大发射波长525nm下检测荧光
检测步骤
一、装载探针
刺激时间较短（通常为2 h以内）的细胞：先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。
刺激时间较长（通常为6 h以上）的细胞：先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
1、原位装载探针（仅适用于贴壁细胞）
2、收集细胞后装载探针（适用于贴壁细胞和悬浮细胞）
二、检测
原位装载探针法：激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
收集细胞后装载探针：用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。
注意事项
① 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
② 探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否
良好。
③ 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
④ 根据结果显示的整体荧光强度的高低，可以适当调整DCFH-DA探针的稀释倍数以及孵育时间。
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