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siRNA转染实验步骤及实验原理
siRNA是目前基础研究中最常用的基因沉默（基因干扰）形式之一，方便快捷，在各种真核生物的基因功能研究，药靶发现及药物筛选中广泛应用。常规siRNA产品为冻干粉形式的即用型试剂，-20°保存。进行特异性靶点设计，覆盖人、小鼠、大鼠全基因组的所有基因，借助化学转染技术适合进行各种细胞RNAi实验。此外，通过对siRNA进行特殊化学修饰，可以实现在体内实验更加高效、特异、稳定。
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siRNA转染原理
siRNA在细胞中降解mRNA的机制与miRNA类似（如上图），合成的siRNA通过胞吞进入细胞中，随后少量的 siRNA 能够发生溶酶体逃逸进入细胞质，进入细胞质后siRNA与 Dicer 及 TRBP 形成 RISC复合物，RISC复合物招募 AGO2，随后正义链被降解，siRNA 反义链与完全互补配对的 mRNA 序列结合，接着 AGO2 对mRNA 进行切割，最终引起 mRNA 的降解。
siRNA转染实验步骤（下面以 24 孔板为例，其他培养皿中转染可以咨询李记生物）
1、接种细胞
对于贴壁细胞：转染前一天，将细胞按照每孔1-2x10^5个细胞的量进行铺板，使其在转染时密度为60%-80% 为佳。
对于悬浮细胞：转染当天，配制转染试剂-核酸复合物之前，用PBS清洗细胞1-2次，用250 μL Opti-MEM I 减血清培养基 (无血清) 重悬细胞，在24孔板中进行细胞铺板，细胞密度为60-80%。
2、准备转染试剂-siRNA复合物（或转染试剂-miRNA复合物）
(1)对于每孔细胞，取2 μLsiRNA (20 μM，DEPC水溶解)加入到1.5mL离心管中，加入2 μL转染试剂与siRNA 混合，室温孵育3 min。
(2)往上述混合物中加入100 μL Opti-MEM I减血清培养基(无血清)，轻轻混匀，在室温下静置30 min，形成转染试剂-核酸复合物。
(3)30 min后，往上述复合物中加入250 μLOpti-MEM I减血清培养基(无血清)，轻轻混匀。
3、转染细胞
(1)细胞用PBS清洗1-2次，将上述350µL转染试剂-siRNA复合物加入每孔细胞。
(2)在 37℃，5% CO2 培养箱培养 24-48 h，无需更换新的培养液，之后即可检测基因干扰效果或者后续功能实验。注：可在转染12h后补充500 μL完全培养基。
siRNA转染效率验证
siRNA沉默效果分析siRNA 转染细胞后，siRNA 在 细胞内一系列酶的作用下形成RNA诱导的沉默复合物，识别并切割靶基因mRNA，诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应， 从而抑制了细胞内目的基因蛋白的表达，一般可从两个方面进行检测。
• mRNA 水平 - QPCR检测
siRNA的作用机理在于其引起靶基因mRNA的降解，因此mRNA的降解水平是siRNA 沉默效率的直接证明。一般在siRNA转染后24小时后即可检测到靶mRNA水平的降低，可采用细胞总RNA提取，全长cDNA合成，荧光定量实验即可检测到mRNA 的敲除效率。
• 蛋白水平 - WB检测
siRNA引起靶基因mRNA的降解，从而影响了靶蛋白的表达。但蛋白水平检测时间受细胞内目的蛋白表达量、稳定性、半衰期、甚至其他调控等因素的影响，蛋白质水平下降的幅度与mRNA水平下降不一定成线性正比关系。一般在转染后48后开始WB检测，72，96 小时，甚至更长时间之后多点采样。
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