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一文看懂 | 如何用Annexin VPI法做细胞凋亡检测
细胞凋亡过程常伴随着明显的细胞形态学变化，比如细胞凋亡早期，质膜内侧的磷脂酰丝氨酸会翻转到细胞质膜表面；而在凋亡的中后期，随着细胞质膜通透性的增大，一些较大分子的化合物，如碘化丙啶(PI)，便可自由扩散进入细胞，将细胞核染上红色荧光。
Annexin VPI检测法原理
Annexin V是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。它不能透过完整的细胞膜，而早期凋亡细胞的细胞膜是完好的，对PI有拒染性。但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能透过细胞膜而使细胞核染上。因此Annexin V 和PI同时使用，可以将凋亡早期的细胞与其它细胞区别开来。
Annexin VPI凋亡检测推荐（李记生物）
[名称] 流式凋亡检测试剂盒
[货号] AC12L033
[规格] 100T
Annexin VPI检测法操作步骤
▶ 对照管的设置
1、空白管：诱导凋亡的细胞不加染料，用来调节电压；
2、单染管：分别需要只加PI和荧光标记的Annexin V两个单染管，用来调节补偿；
3、实验管：诱导凋亡的细胞加本次实验的所有荧光染料；
4、阴性管：正常培养细胞加入染料，确认细胞正常状态，排除假阳性。
▶ 悬浮细胞收集染色
1、在进行完细胞凋亡刺激后，离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。
2、取1~5×10^5重悬的细胞，离心5分钟，弃上清，加入500µl 结合液轻轻重悬细胞。
3、加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入5 μL 碘化丙啶，轻轻混匀。
4、室温避光孵育10分钟。可以使用铝箔进行避光。
5、随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。
▶ 贴壁细胞收集染色
1、把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，用胰酶细胞消化液(最好不用含有EDTA)消化细胞。
2、细胞消化下来后，同理悬浮细胞的操作步骤。
▶ 上机检测
染色孵育后，立即进行流式细胞仪检测或荧光显微镜检测。
Annexin VPI流式结果图（仅做参考）
图：流式细胞仪凋亡检测结果图
✔ 左上象限(Annexin V-/PI+)：为细胞碎片、机械损伤细胞或其它死细胞；Annexin V-/PI+象限中细胞数越多，实验结果可信度就越低，因尽量控制本象限细胞比例。
✔ 左下象限(Annexin V-/PI-)：为正常的活细胞；
✔ 右上象限(Annexin V+/PI+)：为晚期凋亡细胞或坏死细胞，细胞膜损伤的细胞DNA可被PI着染产生红色荧光；
✔ 右下象限(Annexin V+/PI-)：为早期凋亡细胞，在细胞凋亡的早期PI无法着染，不会产生红色荧光信号。
Annexin VPI检测法注意事项
• 检测贴壁细胞时，若不好控制消化时间，建议用Accutase细胞消化液，对细胞损伤小且不会改变细胞膜上PS的分布。
• 选择Annexin-V的荧光染料时要考虑细胞的自发荧光，特别是培养时间久或药物处理的细胞，一定注意细胞代谢物药物本身的荧光，一般来说细胞代谢物的自发荧光会干扰FITC/PE，所以可建议用Annexin-V APC，药物的干扰可查看药物本身的发射光谱是否会对检测选择的染料有影响。
• 细胞染色完成后，禁止固定，尽快检测完，可将检测管放冰上，可减少外界环境对检测结果的影响。
• 在做凋亡统计时一般指统计前凋亡，因为只有前凋亡才有意义，当然也有文献统计总的凋亡比例（前凋亡和晚期凋亡之和），单纯的统计晚期凋亡比例意义不大。
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