常见问题-试剂产品问题解答-和元李记

Q：cck8检测数据为什么重复性差？
1、孔板最外圈试剂容易挥发，建议最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。 2、CCK-8沾壁，建议加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。 3、细胞数量过多或过少，建议预先在1000-100000个/孔范围内摸索条件。 4、孔内气泡干扰酶标仪检测，检测前需确保每个孔内无气泡。
Q：cck8试剂盒为什么测出的吸光度数值较低？
1、细胞数量过低。可以适当增加细胞待测数量。 2、染色难度大，建议增加CCK-8孵育时间。
Q：cck8细胞存活率测定公式计算是什么？

活力计算：细胞活力×（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100
【注】A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度
A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
Q：细胞在液氮中可以保存多久?
细胞冻存可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
Q：细胞冻存的最佳时间是什么时候?
细胞在体外生长期间，通常分为三个阶段:潜伏期、指数生长期和平台期。潜伏期通常是细胞刚刚传代，此时细胞开始贴附基质和伸展骨架，代谢活动集中在粘附蛋白和骨架蛋白的表达，细胞量在这段时间内几乎没有增加。随后，细胞开始指数生长期，核酸转录翻译旺盛，DNA解旋、配对频繁，胞内物质传递迅速，细胞数量迅速增长。如果在这个时期冻存，实际上是强行将细胞冻结在代谢的某一时刻，势必造成对解旋的DNA、转录翻译中的RNA和蛋白的机械损伤，增加个别环节发生错误的风险。随着细胞数量的增长，培养容器内，细胞汇合达到90%以上。大部分细胞因为“接触抑制”而停止高速代谢和增殖，胞内活动趋于平缓。所以，我们建议在刚刚进入平台期时冻存细胞，既可以获得足量的细胞，也不会对细胞造成过多的机械损伤。
Q：高效进行细胞冻存应该注意些什么？
1.缓慢冷冻：慢冻可使细胞逐步脱水，细胞不会因产生大的冰晶而受到损害。相反，细胞内若出现大结晶会引起细胞膜、细胞器的损伤和破裂。 2.细胞活力及浓度：细胞应在生长良好、致密度约为80-90%活力达90%以上的状态下冻存。细胞活力差的细胞在冻存后的成活率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存。　 3.冻存密度：冻存时细胞密度少于5x105个活细胞/mL时，很难成功复苏。　　 4.冻存管盖子：冻存管的盖子一定要拧紧，否则水浴复苏时水会渗入造成污染。　　 5.冻存时间：细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。我们建议在-80℃冰箱中的保存时间不要超过48h。
Q：细胞冻存为什么要添加保护剂？
细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术，细胞在不加任何保护剂的情况下冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶从而引发一系列的不良反应：　　首先，部分蛋白质因局部电解质浓度增高和pH值改变而变性，导致细胞内部空间结构发生改变。　其次，细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质，酶的变性等会限碍细胞的能量代谢。再次，胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变，使细胞内容物丧失。　　最后，随着冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成DNA的空间结构发生损伤从而引起细胞死亡。　　添加冷冻保护剂可以很好的改善细胞的破坏与死亡情况。
Q：PBS溶液与DPBS溶液的区别
PBS能够提供相对稳定的离子环境和 pH 缓冲能力，一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。是生物学中经常使用的缓冲盐溶液，用于分子克隆等。DPBS是用于短期维持细胞活性的一种平衡盐溶液。在有限时间内维持离体细胞结构和生理学上的完整性。pH 为 7.2-7.4，与人体 pH 相近，溶液渗透压与人体血液等渗，不含 Ca2+、Mg2+。适用于各种细胞培养应用，例如解离前清洗细胞、运输细胞或组织、稀释细胞进行计数和制备试剂。其实PBS是一类磷酸盐缓冲溶液的总称，虽然有常用的配方，但并不局限于某一种。DPBS即是Renato Dulbecco根据自己的实验需求自行改进的一种PBS溶液，因较为常用，所以沿用下来成为相对固定的名称。本质上都属于磷酸盐缓冲溶液，根据常用的配方来看，两种溶液的成分基本一样，含量稍有不同。可以说DPBS是PBS的一种。
Q：1640培养基多少度保存？
在实验室中，培养基应保存在4℃冰箱中，一般培养基不建议放-20℃保存，因为在-20℃下，培养基中的盐容易析出，培养基融化后，有的盐可能无法重新溶解，从而导致培养基渗透压降低，培养细胞时，细胞容易破裂而死亡。同时在保存过程中，也要避免培养基暴露在高温环境下。在使用前，需要将培养基恢复到室温后再使用。
Q：RPMI1640培养基中可以添加那些补充物？
我们通常都会向RPMI1640培养基中添加一些补充物，例如生长因子、蛋白质、10%胎牛血清、酚红、双抗等，这些补充物根据所培养的细胞类型进行适宜的调整。例如：我们想更直观的观察RPMI1640培养基的PH值，就可以添加酚红。酚红根据PH值的变化会产生不同颜色，有利于科研人员及时调节PH值，这也是RPMI1640培养基为什么会变色的原因之一；当我们想防止细胞污染，我们可以适当的添加双抗溶液，进行抗菌；我们需要丰富的生长因子与营养成分，我们就可以简单的添加10%胎牛血清，来保证RPMI1640培养基中的营养成分适宜。向RPMI1640培养基添加什么补充物，是根据我们的实验设计与目的而进行的。

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