产品描述
Quick Cell探针法支原体检测试剂盒（Quick Cell qPCR Mycoplasma Detection Kit with Probe）采用支原体特异性引物和支原体特异性荧光探针（报告基因为FAM），用于对样品的支原体基因组DNA进行荧光定量PCR扩增检测。试剂盒内同时含有内参对照质粒mycoIC2和相应的引物和荧光探针（报告基因为VIC），用于监控支原体DNA提取和qPCR扩增的效率。本试剂盒可用于检测一切可能含支原体的样品，比如：体外细胞培养的上清、血清、各种体液（如唾液、尿液、鼻腔分泌物）、别的液体样品。
经多次测试，本试剂盒有记录可以识别在体外细胞培养中曾经报道出现的20种支原体。根据文献报道，这些支原体基本上占污染细胞的支原体种类的100%。具体如下：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、(11) M. bovoculi、（12）A. axanthum、（13）M. buccale、 (14) M. pneumoniae、（15）M. arthritidis、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum、（19）M. canis、（20）Ureaplasma urealyticum（M.为Mycoplasma的缩写；A.为Acholeplasma的缩写）。
产品组分
产品组分 | 规格 |
探针法溶液1P（50T） | 550 μL，含支原体和内参检测用引物及荧光探针 |
探针法溶液2T（50T） | 50 μL，酶溶液 |
内参质粒mycoIC2 | 500 μL |
去离子水 | 1.2 mL |
阳性支原体DNA | 50 μL |
注：①本试剂盒由于含有内参质粒mycoIC2（用于监控支原体DNA提取和qPCR扩增的有效性），客户可以选择进行样品支原体DNA的提取（内参质粒mycoIC2在支原体DNA提取过程中加入），也可以选择不进行样品支原体DNA的提取（内参质粒mycoIC2在配制体系时加入）。
②本试剂盒的配套仪器可以是任何具有FAM和VIC检测通道的荧光定量PCR仪。
运输与保存
蓝冰运输。-20℃避光保存，有效期60个月。
注意事项
1.本产品主要用于细胞上清支原体污染检测，仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
2.防DNA污染注意事项：
(1) 强烈建议所有操作（特别是qPCR体系配制步骤和吸取试剂盒中试剂的时候）使用滤芯吸头进行操作，以免试剂被污染。
(2) 必须确保使用的移液枪本身没有残留的支原体。
(3) 样品前处理的各类吸头、离心管，以及吸取阳性对照DNA、待测样品DNA的吸头，务必小心处理，请将其装入含有半瓶水的带盖的、可密封的瓶子内，全部样品吸取完后，盖上瓶盖，以防止阳性DNA的挥发，造成环境的污染，进而造成假阳性。整个操作过程，最好不要说话，因为人的口腔和唾液都是带支原体的。
(4) 反应后，请勿打开反应管的盖子，否则有可能造成检测环境的污染。结果判断完后，将其用自封袋密闭后，进行适当处理。
3.实验室必须严格分房间操作（本试剂盒建议在有窗户、通风良好的普通房间内操作，请勿在密闭的房间操作。请勿在细胞培养间进行该步骤的操作，因为细胞培养间支原体污染概率很高）：
试剂配制房间1：专门进行定量PCR体系的配制（建议该房间全部使用进口滤芯吸头。）
DNA提取房间2：专门进行支原体DNA的提取；
DNA加样房间3：专门进行定量PCR体系配制后，添加待测样品、阳性对照、阴性对照等操作；
PCR扩增房间4：进行实时荧光PCR扩增检测。
注：如果房间紧张，可以考虑将房间2、房间3合并在一个房间，而房间1和房间4必须独立。各房间物品（包括移液枪）均为专用，不得交叉使用。
4.如果出现qPCR的扩增被细胞的代谢产物抑制时（qPCR结果：支原体通道和内参对照通道均无扩增曲线），可以采取以下几种措施：
(1) 将取样的时间提前到换液后2 d或3 d，此时细胞上清的PCR扩增抑制物相对比较少，一般不会产生严重的抑制。据我们测试，换液后5 d，PCR扩增抑制物就已经大量积累。
(2) 用PBS对待测样品进行离心清洗，去除样品中的抑制物。具体方法如下：取1 mL细胞上清，先13000 rpm离心10 min，吸走950 μL上清；加PBS 950 μL，再次离心，吸走950 μL上清；再加PBS 950 μL，第三次离心，小心吸走全部上清（为避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液体），用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重悬沉淀，95 ℃加热处理5 min，简单离心（1000 g，5 sec）后，取上清进行检测。但是该方法有如下缺点：第一，如果样品支原体含量较少，离心清洗可能导致漏检，因为离心清洗过程中，可能导致支原体部分丢失。第二，个别样品，即使经过上述清洗也无法彻底去除抑制剂。
(3) 抽提细胞上清的支原体DNA后再进行PCR鉴定。
(4) 使用李记生物的Quick Cell支原体快速检测试剂盒（细胞培养专用）（货号：AC16L061）或者Quick Cell 发光法支原体检测试剂盒（货号：AC16L062）进行检测，经测试，未发现这两种试剂盒会被细胞的代谢产物所抑制。为了预防PCR的扩增被细胞的代谢产物抑制的问题，也可以考虑将所有待测样品全部进行离心清洗或者DNA提取后，再使用本试剂盒进行检测。
5.支原体检测样品可以分成两类：第一类，用含血清的培养液培养的哺乳动物细胞上清液，由于该条件非常适合支原体生长，培养数天后，支原体密度一般较高，可达107-9/mL，可以直接检测。第二类，低温保存的血浆、血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液等样品，由于这些样品即使有支原体污染，支原体含量一般很少，直接使用快速支原体检测试剂盒进行检测，往往检测不出来。这些样品建议：（1）对样品的支原体进行离心浓缩将支原体DNA浓缩提取，该两种方法大约可以将检测灵敏度继续提高10-100倍。该方法速度快，当天出结果，但是可靠性不如后面的培养法。（2）使用支原体液体培养基（必须同时接种不含精氨酸和含精氨酸的两种支原体液体培养基）培养3-7 d后，再进行检测。具体方法请参考李记生物Quick Cell 发光法支原体检测试剂盒（货号：AC16L062）说明书中最后的注意事项部分。该方法速度较慢，需要3-7 d，但是可靠性高。
6.如何提高本试剂盒检测灵敏度：如果预期待测样品支原体含量较少（比如，低温保存的血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液、生物制品、极个别细胞培养上清等），可以采取以下几种措施：（1）将支原体DNA浓缩提取后再进行检测（提取过程还可以把所有可能的PCR抑制剂全部去除），大约可以将检测灵敏度提高10-100倍。（2）对支原体进行离心浓缩：取1 mL细胞上清，先13000 rpm（约16000 g）离心10 min，吸走全部上清，用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重悬沉淀，95 ℃加热处理5 min，简单离心后（1000 g，5 sec），取上清进行检测。该离心浓缩过程大约可以将检测灵敏度提高20倍。（3）如果样品是未经提取的，可以通过增加反应管中样品DNA的加入量，比如由原来的2 μL增加到18 μL，如此可以提高检测灵敏度9倍（没有提取纯化或者离心清洗的待测样品，一般不能直接扩大待测样品体积，否则PCR被抑制的可能性将大幅度增加。）
7.如发现细胞被支原体污染，推荐使用李记生物的Quick Cell支原体祛除预防试剂盒（货号：AC16L066）、EZ 水浴锅抑菌剂（货号：AC16L162）、EZ 细胞房除菌剂（货号：AC16L143）。产品详情可咨询销售人员或见官网：life-ilab.com
本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
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