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转录组学

转录组测序(RNA-Seq)是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序,全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。 随着后基因组时代的到来, 转录组学、蛋白质组学、代谢组学 等各种组学技术相继出现,其中转录组学是率先发展起来以及应用最广泛的技术。RNA-Seq具有以下优势:(1)通量高,运用第二代测序平台可得到几个到几百亿个碱基序列,可以达到覆盖整个基因组或转录组的要求;(2)灵敏度高,可以检测细胞中少至几个拷贝的稀有转录本;(3)分辨率高,RNA一Seq的分辨率能达到单个碱基,准确度好,同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题;(4)不受限制性,可以对任意物种进行全转录组分析,无需预先设计特异性探针,能够直接对任何物种进行转录组分析。同时能够检测未知基因,发现新的转录本,并准确地识别可变剪切位点及SNP、UTR区域。RNA-seq技术能够在单核酸水平对特定物种的整体转录活动进行检测,从而全面快速地获得该物种在某一状态下的几乎所有转录本信息。由于转录组测序可以得到全部RNA转录本的丰度信息,加之准确度又高,使得它具有十分广泛的应用领域。主要应用于:(1)检测新的转录本,包括未知转录本和稀有转录本;(2)基因转录水平研究,如基因表达量、不同样本间差异表达;(3)非编码区域功能研究,如microRNA、非编码长RNA (IncRNA)、RNA编辑;(4)转录本结构变异研究,如可变剪接、基因融合;(5)开发SNPs和SSR等。原文链接:和元生物——转录组学

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miRNA测序

小RNA是生物体内一类具有重要调控功能的非编码短小RNA的总称。大量研究已经证实,小RNA几乎参与调控了动植物所有的生命过程,包括细胞增殖,分化,凋亡等,并且与人类疾病的发生发展密切相关。小RNA测序正是对这一类重要的调控小RNA——特别是microRNA(miRNA)展开分析,利用高通量测序技术对样本中18~30nt的小RNA序列进行鉴定和分析。技术优势文库优化:针对动植物miRNA序列的不同特别,优化文库制备流程,最大程度地富集样本小RNA序列独家分析软件:拥有自主开发的数据分析软件ACGT101-miR,可靠性已被数百个实验项目检验;生成图表可直接用于论文撰写。项目经验丰富:国内最早提供小RNA测序服务的公司之一,用户已发表上百篇小RNA测序相关论文。技术路线Total RNA3’及5’接头连接反转录PCR扩增PAGE纯化上机测序(HiSeq 2500,SE50)数据分析分析内容1、数据质控:测序质量值分布统计;测序碱基质量控制;测序数据产出统计。2. 可比对测序数据的获得3. miRNA数据库以及测序物种基因组比对4. 与其他RNA数据库的比对5. 预测全新的miRNA6. miRNA序列本身相关分析7. miRNA定量分析,多样品miRNA的表达差异分析;差异表达miRNA筛选;差异表达miRNA统计;miRNA表达模式聚类分析(仅限多样本项目)。8. 重复相关性检测(仅限生物学重复样本)。9. 差异表达miRNA的靶基因预测(植物采用Targetfinder软件,动物采用Targetscan和miRanda软件0)10. 差异表达miRNA的靶基因GO,KEGG注释与GO,KEGG富集性以及pathway 通路分析和pathway network分析。(仅限多样本项目)差异表达miRNA的靶基因GO,KEGG注释与GO,KEGG富集性以及pathway 通路分析和pathway network分析。(仅限多样本项目)样本类型细胞,组织,体液、血清、血浆、全血,总RNA等建议总RNA起始量:5 μg,最低2.5 μg,浓度≥120 ng/μL样本类型1.Wu S, Li Y, Chen S, Liang S, Ren X, Guo W, Sun Q, Yang X. (2017) Effect of dietary Astragalus Polysaccharide supplements on testicular piRNA expression profiles of breeding cocks. International Journal of Biological Macromolecules 103(1), 957-964.2.Tritten L, Tam M, Vargas M, Jardim A, Stevenson MM, Keiser J, Geary TG. (2017) Excretory/secretory products from the gastrointestinal nematode Trichuris muris. Experimental Parasitology 178(1), 30-36.3.Sun J, Yao L, Chen T, Xi Q, Zhang Y. (2017) The effect of dietary ginseng polysaccharide supplementation on the immune responses involved in porcine milk-derived esRNAs. bioRxiv [Epub ahead of print].4.Ghorecha V, Zheng Y, Liu L, Sunkar R, Krishnayya NSR. (2017) MicroRNA dynamics in a wild and cultivated species of Convolvulaceae exposed to drought stress. Physiology and Molecular Biology of Plants 23(2), 291-300.5.Li H, Peng T, Wang Q, Wu Y, Chang J, Zhang M, Tang G, Li C. (2017) Development of Incompletely Fused Carpels in Maize Ovary Revealed by miRNA, Target Gene and Phytohormone Analysis. Frontiers in Plant Science 8(1), 463.案例展示同源四倍体和二倍体水稻花粉发育过程中的小RNA分析与比较1.研究背景MicroRNAs (miRNAs)通过抑制其靶基因来调控植物基因的表达,且在植物生殖中起着重要的作用。然而,目前关于同源四倍体水稻miRNA组分析的研究是相当有限的。2.研究结果在这项研究中,研究人员运用小RNA测序对二倍体和多倍体水稻花粉发育过程中的miRNA组进行分析。研究结果表明,与二倍体水稻相比,四倍体水稻中共检测出172种差异表达的miRNAs(DEM),以及57种miRNA在同源四倍体水稻中特异性表达。在这172种DEM中,115种miRNA上调,61种miRNA下调。上调DEM的靶基因GO分析表明,它们的功能富集在减数分裂前间期的膜运输、减数分裂繁殖和单小孢子阶段的核苷酸结合。 osa-miR5788和osa-miR1432-5p_R+1在减数分裂时上调,它们的靶基因揭示了减数分裂相关基因的相互作用,也暗示了它们可能参与染色体行为相关的基因调控。此外,在同源四倍体水稻的花粉发育过程中,发现了丰富的与转座因子相关的24 nt 的siRNA;但是,它们在二倍体水稻中的含量明显下降,表明24 nt的siRNA在花粉发育中可能发挥作用。 图 花粉发育过程中不同阶段miRNA表达的Venn图分析本研究的结果为miRNA在同源四倍体水稻花粉发育过程中所起的作用,以及其与花粉不育性之间的关系提供了新的见解,为理解小RNA表达谱对多倍体的影响奠定了基础。参考文献Li, et al. (2016) Comparative Small RNA Analysis of Pollen Development in Autotetraploid and Diploid Rice. InternationalJournal of Molecular Sciences. 17, 499; doi:10.3390/ijms17040499结果展示1.差异miRNA上下调统计分析差异基因上下调频数统计用于判断不同实验条件下差异表达miRNA的个数。其中横坐标表示比较组信息,纵坐标表示上下调miRNA的数目,红色代表上调miRNA,蓝色代表下调miRNA,其中数字代表上下调miRNA的数目。 2.差异miRNA聚类分析差异miRNA聚类分析用于判断miRNA在不同实验条件下调控的聚类模式。根据样品miRNA表达谱的相近程度,将miRNA进行聚类分析,直观地展示miRNA在不同样品(或是不同处理)中的表达情况,由此获取生物学相关信息。不同的颜色表示不同的miRNA表达水平,颜色由蓝色经由白色至红色表示表达量从低到高。红色表示高表达基因,深蓝色表示低表达基因。 3.差异miRNA韦恩图通过不同比较组之间差异基因韦恩图可以直观地显示出不同比较组之间共同的和特有的差异表达miRNA的个数,差异基因韦恩图具有明显的生物学意义,比如是相同对照不同处理的实验设计情况,可以将不同处理下的差异基因进行比较。4.GO富集性柱状图miRNA靶基因的GO富集柱状图:用于反映在生物过程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)富集的GO term上差异基因的个数分布情况。5.GO富集性散点图对差异miRNA进行GO富集分析并以散点图展示,Rich factor表示位于该GO的差异基因个数/位于该GO的总基因数,P值越小,GO富集程度越高。常见问题 1.miRNA命名规则是怎样的?关于miRNA命名,是根据miRBase的命名规则:物种拉丁名3字母缩写-miR/MIR-编号(植物),miR表示的是microRNA成熟体,植物的前体使用MIR。参见miRBase官网:目前已经不再使用*来标记microRNA与其发夹前体互补配对位置的互补序列,而是使用“-3p”与“-5p”作为区分这两条序列的后缀替代旧的的命名法。具体参考17.0版本出来时,miRbase数据库的blog文章:http://www.mirbase.org/blog/2011/04/mirbase-17-released/ 2.如何筛选差异基因?可以在筛选的时候可能需要参考该参数,一般如果专注于发现,那么全部保留,如果专注于差异表达,可以仅保留high和middle拷贝的。log2(Treat/Control)>0表示上调,1表示上调2倍,0表示上调,1表示上调2倍,3.ACGT101程序的优势有哪些?优势有以下几点:1)分析全程兼顾测序质量打分(phred score);2)比对已报道成熟体之前先与已报道前体序列比对,除了发现全新的miRNA序列,还可以发现另一末端的成熟体序列,以及已报道成熟体的侧翼miRNA序列;3)与其他RNA数据库的比对过滤在于miRBase数据库比对之后,避免了滤除那些少量比对上编码区域的已报道miRNA;4)Table 5结果数据信息丰富全面,全部结果都有迹可循;5)100篇客户参考文献。原文链接:和元生物——miRNA测序

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lncRNA测序

简介:长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200 nt 的非编码RNA(ncRNA),广泛存在于各种生物体内,在表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用,与动植物的生长发育,人类的疾病发生有着密切关系,也可作为疾病诊断的标志物或是重要靶点。利用高通量测序技术进行lncRNA 测序及生物信息学分析,可快速准确地发现那些具有重要调控功能的lncRNA,分析其与特定生物学过程的关系,深入探索lncRNA的功能及其表达调控机制。包括竞争结合miRNA的ceRNA调控机制,及对染色质结构进行一系列调控如增强子、启动子、绝缘子等。 样本起始量与送样建议样本类型起始量动物及临床脏器组织/脑组织等>20mg动物及临床皮肤/骨/血管/脂肪组织等>100mg植物叶片组织/花>200mg植物根/茎/果实/种子>500mg原代细胞/细胞系>5×106个中性粒细胞/嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞>5×107个外泌体样本>1×108个血清/血浆/脑脊液/关节积液/卵泡液>2mL细胞培养上清液>20mL尿液>30mL总RNA>1μg且RIN>7.0注意事项:① 组织样本建议保存在RNAlater、RNAHold、RNAProtect等相关组织保存液中,然后-80℃保存或干冰寄送;② 细胞样本使用TRIzol等裂解液充分裂解之后,-80℃保存或干冰寄送③ 更加详细的样本准备指南,请联系在线客服 生物信息学分析流程与分析内容lncRNA分析内容 备注 测序数据质控测序原始数据量及cleandata数据量统计测序质量Q20 Q30 GC含量统计,去除原始下机数据中的接头、低质量及污染序列基因组比对参考基因组比对/区域比对染色体密度分布表达分析基因/转录本表达总谱样本基因表达值分布统计样本不同基因表达值区间分布统计样本基因转录本覆盖深度统计基因表达值密度图基因表达水平盒型图样本相关性分析Pearson/Sperman相关性分析PCA聚类分析mRNA分析基因差异分析转录本差异分析差异基因火山图差异基因整体统计图差异基因聚类热图差异基因GO富集分析差异基因KEGG富集分析GSEA分析lncRNA分析转录本重构和lncRNA预测lncRNA表达分析lncRNA差异表达分析差异lncRNA火山图差异lncRNA整体统计差异lncRNA聚类热图lncRNA和mRNA结构特征比较lncRNA和mRNA长度比较lncRNA和mRNA的ORF分布lncRNA和mRNA外显子数目统计lncRNA和mRNA表达水平统计lncRNA靶基因预测lncRNA靶向差异基因GO富集分析lncRNA靶向差异基因KEGG富集分析SNP/INDEL分析SNP/INDEL数目统计SNP/INDEL所在位置SNP突变型态统计基因区域SNP和INDEL注释可变剪切分析可变剪切类型统计可变剪切可视化 应用场景与案例 应用场景1:启动子/增强子调控适用范围:非线性转录调控、新顺式作用元件发现及功能鉴定、组织特异性启动子筛选及确定等研究lncRNA的自身转录会干扰其邻近编码蛋白的基因的转录。上游lncRNA转录时,会穿越邻近靶基因的启动子区,干扰了转录因子与靶基因的启动子结合,从而抑制靶基因的转录。此外,lncRNA具有促进增强子环化和激活基因表达的功能。在没有成环的情况下增强子处于非活性状态。应用场景2:与蛋白修饰/DNA甲基化/m6A联合适用范围:临床医学、基础医学、植物遗传育种等研究lncRNA参与表观调控,可能是招募一些染色质重构复合体来介导基因沉默,尤其是一些与组蛋白修饰相关的组蛋白甲基转移酶的调控。此外,lncRNA还能与一些DNA甲基化和去甲基化酶结合使得基因的启动子区发生甲基化的变化从而影响基因表达。应用场景3:ceRNA调控机制适用范围:环境应激、临床医学、植物遗传育种、疾病早期诊断等研究ceRNA全称competing endogenous RNA,是一种能够竞争结合RNA的作用元件。通常lncRNA和circRNA会竞争结合miRNA,我们一般把lncRNA和circRNA可以称作ceRNA。ceRNA调控网络全称ceRNAregulation network,指的是有ceRNA参与的整个调控网络cascade。而ceRNA分析指的是对整个ceRNA调控网络进行分析。一般有circRNA-miRNA-mRNA分析或lncRNA-miRNA-mRNA分析。 项目流程 和元生物真核有参转录组测序可以为研究人员提供从样本提取、建库测序、数据分析等一系列完整的服务流程,提供高质量的数据结果,并为后续研究提供强有力的参考依据。原文链接:和元生物——lncRNA测序

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单细胞测序

原文链接:和元生物——单细胞测序单细胞测序技术,是在单个细胞水平上对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术。它能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态,反映细胞间的异质性,在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等领域发挥重要作用,正成为生命科学研究的焦点。单细胞测序工作流程单细胞测序的工作流程包括 4 个关键步骤 :1) 单细胞制备,2)单细胞分离和文库制备,3)测序和初级分析,4)数据可视化与解读。在整个工作流程中,有一些影响结果并决定研究能否成功的实验注意事项和关键步骤。想要获得准确的数据,得出有意义的结论,需要精心设计实验,并按要求开展实验。在过去的十年中,随着细胞分离新技测序新方法术和单细胞和新应用的发展,单细胞鉴定和研究领域取得了重大进展。随着单细胞分离和检测的选项越来越多,实验方案的多样性显著增加,每种方案都有其固有的优缺点。因此,研究人员面临着诸多决策问题,例如细胞通量、测序深度、所需转录本长度、是否应纳入表观遗传或蛋白水平测量等。想要充分利用单细胞测序来阐明复杂的生物系统,精心设计实验和优化工作流程的每个步骤至关重要。研究人员必须有明确的生物学目标和合理的实验设计,才能选择出针对其研究问题的最佳方法。

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真核转录组测序

简介:转录组广义上指特定细胞在某一功能状态下的所有转录产物,包括mRNA 和非编码RNA(ncRNA)。是连接基因组遗传信息与生物功能的必然纽带。真核生物转录组测序基于高通量测序,可快速获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下的所有转录本的集合,用于研究基因结构和基因功能、可变剪接和新转录本预测等。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构,已经成为揭示生物生长发育调控和逆境胁迫适应机制、生物进化规律、疾病发生发展的重要机制以及发现致病基因调控的关键靶点等方面的优先研究手段,目前已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发、动植物育种等各个领域。特色具备处理复杂样本的能力丰富的建库经验,加入文库均一化技术协助客户快速、准确地进行生物信息分析可结合客户的需求灵活进行定制化信息分析样本起始量与送样建议样本类型起始量动物及临床脏器组织/脑组织等>20mg动物及临床皮肤/骨/血管/脂肪组织等>100mg植物叶片组织/花>200mg植物根/茎/果实/种子>500mg原代细胞/细胞系>5×106个中性粒细胞/嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞>5×107个总RNA>1μg且RIN>7.0注意事项:① 组织样本建议保存在RNAlater、RNAHold、RNAProtect等相关组织保存液中,然后-80℃保存或干冰寄送;② 细胞样本使用TRIzol等裂解液充分裂解之后,-80℃保存或干冰寄送③ 更加详细的样本准备指南,请联系在线客服生物信息学分析流程与分析内容有参转录组分析内容备注测序数据质控去除原始下机数据中的接头序列、污染序列和低质量错误序列数据量统计和质量评估序列比对和转录本重构参考基因组比对统计下机数据比对上基因组的比例参考基因组比对区域分布统计比对上基因组的序列外显子和内含子所占比例参考序列染色体密度分布染色体上比对序列分布统计转录本重构包含序列merged.fa和.gtf文件基因/转录本总体表达分析基因表达总表转录本表达总表基因和转录本表达量分布盒形图基因和转录本表达量区间分布统计转录本覆盖深度统计基因和转录本表达量分布密度图差异表达基因/转录本分析(样本数≥2)差异表达基因和转录本统计柱状图差异表达基因和转录本表达谱差异表达基因和转录本火山图差异表达基因和转录本聚类热图差异表达基因GO富集分析包含GO富集柱状图、散点图、雷达图等差异表达基因KEGG富集分析包含KEGG通路富集散点图、通路图、雷达图等差异表达基因Reactome富集分析(只包含常见19个物种)包含Reactome富集散点图、柱状图等差异表达基因DO(疾病注释数据库)富集分析(只包含物种为人的)包含DO数据库富集散点图、柱状图等结构分析可变剪接分析默认提供ASprofile的可变剪切分析结果,可以售后免费提供rMATS的差异可变剪切分析结果SNP/InDel分析样本相关性(样本数≥2)相关系数图和PCA(主成分分析)图应用场景与案例应用场景1:差异基因筛选与功能分析适用范围:临床医学、基础医学、生物化学、动植物及真菌研究等任意方向利用真核有参转录组测序,可通过比较实验组和对照组基因表达量筛选差异表达的基因。然后对差异表达基因进行进一步锁定,如通过GO、KEGG富集分析及GSEA分析,配合Pubmed中已发表的文献以及课题组中已积累的部分明星分子对差异表达基因进行功能注释,并进一步分析关注的功能基因。进入实验验证阶段后可对筛选到的差异基因进行qPCR、Northern、Western Blot、FISH验证、基因敲除及过表达等。应用场景2:时序分析或浓度梯度分析适用范围:临床样本、细胞样本、动植物样本有多个时间段的样本,或不同药物浓度处理的样本在转录组数据分析过程中,有一类特殊的实验设计。通过对不同时间段的实验样本进行搜集,或测试不同的药物、试剂等浓度梯度的样本进行采集。继而研究不同基因在不同时间段或不同浓度梯度间的表达规律,这一类分析通常称之为“时序分析”应用场景3:转录因子/调控因子/剪切因子等上游调控基因挖掘适用范围:临床医学、基础医学、生物化学、动植物研究等任意研究方向常规转录组差异分析极有可能得到大量的差异基因,这对后期实验验证的目标锁定带来挑战。在没有特定感兴趣的通路及明星分子前提下,转录因子是一个非常不错的切入方向。转录因子可以调节基因组DNA开放性、募集RNA聚合酶进行转录过程、募集辅助因子调节特定的转录阶段,调控诸多生命进程,诸如免疫反应、发育模式等。所以,分析转录因子表达及其调控活性对于解析复杂生命活动具有重要意义。其他调节因子包括可变剪切等调控基因也可以参与上游调控。应用场景4:大样本研究适用范围:动植物育种、遗传群体与物种起源、人群队列与生物标志物挖掘随着测序技术的飞速发展,少量样本的转录组测序研究已经无法解释复杂的生物学问题。研究者们已开始利用大样本量的转录组样本,结合统计学与机器学习等方式,知道符合特定规律和研究目的的核心基因。如孟德尔随机化、相关性分析、线性回归、LASSO回归、Cox回归等,分析不同样本基因或基因组多样性,挖掘更深入和全面的生物学意义。项目流程和元生物真核有参转录组测序可以为研究人员提供从样本提取、建库测序、数据分析等一系列完整的服务流程,提供高质量的数据结果,并为后续研究提供强有力的参考依据。同时和元生物转录组有参云分析目前已全面升级,为客户提供多种分析内容,满足研究人员标准和和个性化的分析需求。原文链接:和元生物——真核转录组测序

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circRNA测序

简介:共价闭合、单链环状的RNA(circRNA)是一类比较特殊的RNA,其没有游离的5′帽子结构和3′ poly(A)结构,并且对核酸酶不敏感,因此比普通的线性RNA(linear RNA)更稳定。随着高通量测序以及生物信息分析技术的快速发展,在不同物种中鉴定出成千上万个circRNA,其中大多数circRNA 在不同物种间具有保守性和稳定性,并且circRNA 的表达具有细胞特异性、组织特异性以及发育阶段特异性。circRNA除了常规的对miRNA竞争结合的ceRNA调控机制外,还有翻译多肽等新功能,在医学及动植物基础研究及后期转化上有着巨大的潜力。样本起始量与送样建议样本类型起始量动物及临床脏器组织/脑组织等>20mg动物及临床皮肤/骨/血管/脂肪组织等>100mg植物叶片组织/花>200mg植物根/茎/果实/种子>500mg原代细胞/细胞系>5×106个中性粒细胞/嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞>5×107个外泌体样本>1×108个血清/血浆/脑脊液/关节积液/卵泡液>2mL细胞培养上清液>20mL尿液>30mL总RNA>1μg且RIN>7.0注意事项:① 组织样本建议保存在RNAlater、RNAHold、RNAProtect等相关组织保存液中,然后-80℃保存或干冰寄送;② 细胞样本使用TRIzol等裂解液充分裂解之后,-80℃保存或干冰寄送;③ 更加详细的样本准备指南,请联系在线客服生物信息学分析流程与分析内容circRNA分析内容 备注 测序数据质控原始数据质控统计表参考基因组比对分析参考基因组基因统计表参考基因组比对reads统计表样本circRNA鉴定数目统计表参考基因组比对区域分布统计图表参考基因组非线性比对区域分布统计图表circRNA鉴定定量分析circRNA拟合序列circRNA表达谱circRNA的BSJ统计表circRNA统计分析circRNA类型统计饼图circRNA表达量分布统计箱线图circRNA表达量密度分布图circRNA染色体数量分布统计图表circRNA外显子数目统计图表亲本基因circRNA数目统计图表circRNA差异分析差异circRNA数目统计图CaseVSControl比较组circRNA差异表达分析CaseVSControl比较组circRNA火山图CaseVSControl比较组circRNA热图CaseVSControl比较组circRNA散点图应用场景与案例应用场景1:结构分子招募核心蛋白与核酸适用范围:基础医学、生物化学与分子生物学等任意研究方向lncRNA和circRNA有时候会作为一种特殊的RNA分子,形成蛋白-蛋白复合物或蛋白-核酸的骨架分子,对下游分子行使一系列调控作用。如部分circRNA会招募一些泛素化酶对下游的蛋白行使降解功能,或者部分lncRNA会招募一些转录因子与目的基因的启动子区域结合激活下游的基因表达等。应用场景2:外泌体适用范围:临床与转化医学、基础医学等任意研究方向lncRNA在外泌体中由于以碎片形式存在,这种随机片段不仅不利于检测,而且较低的浓度和较差的重复性,使得lncRNA并不是外泌体研究的热门分子之一。但是circRNA由于其稳定性,除了从体液样本外泌体中分离circRNA可作为疾病标志物外,还能用于后期的外泌体治疗等领域,是后ceRNA时代中较为热门的circRNA细分研究领域方向之一。其中一个方向是疾病标志物,一般以大样本队列研究居多。一种是后期转化及机制研究方向,包括外泌体受体细胞分子机制研究以及疾病治疗等方向。应用场景3:翻译多肽适用范围:临床与转化医学、基础医学、生物化学与分子生物学等任意研究方向circRNA上有一段未翻译的RNA序列,称为IRES,它可以折叠成类似于起始tRNA的结构,并招募更多的核糖体。正常情况下,IRES不与eIF结合,而是与一类称为ITAF的蛋白质结合。ITAF的作用是将核糖体募集到circRNA的内部结构,以启动蛋白质翻译。此外,还可能存在IRES增强子,类似于circ-ZNF609的UTR元件。也有研究通过翻译组测序与转录组测序,发现了非编码RNA LINC-PINT形成环状RNA后可被翻译形成功能多肽。应用场景4:ceRNA调控机制ceRNA全称competing endogenous RNA,是一种能够竞争结合RNA的作用元件。通常lncRNA和circRNA会竞争结合miRNA,我们一般把lncRNA和circRNA可以称作ceRNA。ceRNA调控网络全称ceRNAregulation network,指的是有ceRNA参与的整个调控网络cascade。而ceRNA分析指的是对整个ceRNA调控网络进行分析。一般有circRNA-miRNA-mRNA分析或lncRNA-miRNA-mRNA分析。项目流程和元生物真核有参转录组测序可以为研究人员提供从样本提取、建库测序、数据分析等一系列完整的服务流程,提供高质量的数据结果,并为后续研究提供强有力的参考依据。原文链接:和元生物——circRNA测序

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慢病毒载体

原文链接:和元生物——慢病毒载体 慢病毒载体(Lentivirus)是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体,是逆转录病毒的一种,基因组是RNA,其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒可将外源基因整合到基因组中实现稳定表达,具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。 慢病毒基因组进入细胞后,在细胞浆中反转录为DNA,形成DNA整合前复合体,进入细胞核后,DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA,回到细胞浆中,表达目的蛋白或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定,并随细胞基因组的分裂而分裂(图1)。   图1 慢病毒包装和侵染细胞的过程   慢病毒载体具有宿主范围广,免疫原性低,基因容量大,可以长期表达等特点。能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。   慢病毒的感染具有整合特性,能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上,达到持久性表达,因而可构建稳定细胞株,用于基因的细胞功能研究。借助慢病毒载体改造T细胞可用于CAR-T细胞治疗。 慢病毒包装与纯化   慢病毒包装采用三质粒或四质粒系统进行包装,收集细胞培养上清,通过超速离心浓缩纯化和收集病毒。 慢病毒滴度检测   检测方法:定量PCR检测感染后细胞基因组中外源DNA拷贝数   实验原理:慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组 慢病毒载体优势 ① 表达时间长:慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组上,实现基因长时间稳定的表达,不随细胞分裂传代而丢失,是细胞实验的首选,常用于构建稳定株。② 安全性高:未发现致病性,慢病毒载体改造T细胞用于CAR-T细胞治疗。③ 免疫原性低:直接注射活体组织不易造成免疫反应,适用于动物实验。 不同病毒的生物学特性比较 载体选择   和元生物拥有丰富的慢病毒产品,用于操作编码基因和非编码基因,如lncRNA、microRNA、circRNA,如下慢病毒载体可供您选择(不限于此列表): 调控方式 载体编号 载体名称(载体元件顺序) 真核抗性 荧光 启动子 默认标签 载体容量    过表达 GL127 pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-WPRE N/A EGFP CMV 3FLAG 4.8kb GL121 pSLenti-EF1-EGFP-CMV-MCS-WPRE N/A EGFP CMV N/A 4.4kb GL129 pSLenti-CMV-mCherry-3xFLAG-WPRE N/A mCherry CMV 3FLAG 4.8kb GL119 pSLenti-CMV-MCS-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro N/A CMV 3FLAG 4.4kb GL120 pSLenti-SFH-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG 3.5kb GL107 pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG 3.7kb GL109 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE Puro EGFP CMV N/A 3.8kb GL122 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-BSR-CMV-MCS-WPRE blasticidin EGFP CMV N/A 3.9kb GL130 pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG 3.7kb GL132 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-WPRE2-CMV-MCS Puro EGFP CMV N/A 3.7kb GL123 pSLenti-EF1-mCherry-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPRE Puro mCherry CMV 3FLAG 3.7kb GL125 pSLenti-CMV-mCherry-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro mCherry CMV 3FLAG 3.7kb GL133 pSLenti-EF1-mCherry-F2A-Puro-WPRE2-CMV-MCS Puro mCherry CMV N/A 3.7kb H114 pLenti-CMV-Luc2-IRES-Puro-WPRE Puro N/A CMV N/A 2.2kb GL124 pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE Puro N/A CMV N/A 2.8kb  表达cre H126 pLenti-CMV-NLS-Cre-3xFLAG-WPRE N/A N/A CMV 3FLAG 3.9kb H15108 pLenti-CMV-DIO-MCS-WPRE N/A N/A CMV 3FLAG 5.3kb 三标 H7656 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-mNeonGreen-F2A-Puro-WPRE Puro mNeonGreen CBh 3FLAG 1.3kb H7657 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-tdTomato-F2A-Puro-WPRE Puro tdTomato CBh 3FLAG 0.6kb H9911 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-mNeonGreen-F2A-BSR-WPRE blasticidin mNeonGreen CBh 3FLAG 1.5kb H9912 pLenti-CBh-3xFLAG-Luc2-tCMV-tdTomato-F2A-BSR-WPRE blasticidin tdTomato CBh 3FLAG 0.8kb circRNA过表达 H8384 pLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-S-circRNA-WPRE N/A EGFP CMV N/A 3.0kb H8807 pLenti-CMV-S-circRNA-WPRE N/A N/A CMV N/A 4.8kb H8399 pLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-L-circRNA-WPRE Puro EGFP CMV N/A 1.0kb H8810 pLenti-CMV-L-circRNA-WPRE N/A N/A CMV N/A 2.8kb miRNA过表达 GL109 pSLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE Puro EGFP CMV N/A N/A H3919 pCLenti-U6-miR30(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE Puro EGFP U6 N/A N/A H119 pLenti-CMV-TurboGFP-IRES-Puro-miR30(miRNA)-WPRE Puro TurboGFP CMV N/A N/A H3928 pCLenti-U6-miR30(miRNA)-CMV-mCherry-F2A-Puro-WPRE Puro mCherry U6 N/A N/A H146 pCLenti-EF1-Puro-CMV-EGFP-3xFLAG-Sponge(miRNA)-WPRE Puro EGFP CMV 3FLAG N/A H7505 pCLenti-U6-TuD(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-BSR-WPRE blasticidin EGFP CMV N/A N/A H7506 pCLenti-U6-TuD(miRNA)-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE Puro EGFP CMV N/A N/A 过表达(Tet-on) H125 pLenti-TRE-EGFP-EF1-rtTA3-IRES-Puro-WPRE Puro EGFP TRE N/A 2.0kb H121 pLenti-TRE-EGFP-3xFLAG-PGK-Puro-WPRE Puro EGFP TRE 3FLAG 3.3kb H2057 pLenti-EF1-rtTA3-IRES-Puro-WPRE Puro N/A EF1 N/A N/A shRNA干扰 GL401 pCLenti-U6-shRNA-CMV-Puro-WPRE Puro N/A U6 N/A N/A GL404 pCLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-WPRE N/A EGFP U6 N/A N/A GL427 pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE Puro EGFP U6 N/A N/A GL428 pSLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-Puro-WPRE Puro mCherry U6 N/A N/A H7615 pCLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-BSR-WPRE blasticidin mCherry U7 N/A N/A CRISPR敲除 H5070 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE Puro N/A U6 N/A N/A H7072 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-BSR-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE blasticidin N/A U6 N/A N/A H6825 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-sfGFP-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRE N/A sfGFP U6 N/A N/A H5068 pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPRE N/A EGFP U7 N/A N/A H5450 pLenti-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-espCas9_1.1-WPRE Puro N/A CMV 3FLAG N/A CRISPRa转录激活 H9517 pCLenti-U6-gRNA-MS2-EFS-dCas9-VP64-T2A-BSD-WPRE blasticidin N/A U6 N/A N/A E2577 pCLenti-EF1a-MCP-P65-HSF1-T2A-Hygro-WPRE hygromycin N/A EF1a N/A N/A H7281 pLenti-CMV-dCas9-VP64-T2A-Puro-WPRE Puro N/A CMV N/A N/A 常规应用   体外感染细胞    慢病毒载体能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型原代细胞和大部分细胞系。    慢病毒的感染具有整合特性,能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上,因而可以达到持久性表达,从而构建稳转细胞株,体外进行细胞功能学实验,包括细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡等研究。稳定表达目的基因的肿瘤细胞株还可以进一步构建肿瘤动物模型,进行体内基因功能验证,药效药代,活体成像等检测,进一步研究体内肿瘤发生、发展和转移及药物治疗的效果。   常见MOI列表 细胞名 中文名称 慢病毒感染MOI(参考值) MGC80-3 人胃癌细胞 10 HT-29 人结肠癌细胞 20 RKO 人结肠腺癌细胞 10 Caki-1 人肾透明细胞癌皮肤转移细胞 10 5637 人膀胱癌细胞 10 U-118 MG 人脑星形胶质母细胞瘤 10 RWPE-1 人正常前列腺上皮细胞 20 HeLa 人宫颈癌细胞 10~20 Ca Ski 人宫颈癌肠转移细胞 10 MCF7 [MCF-7] 人乳腺癌细胞 10 A549 人非小细胞肺癌细胞 10 NCI-H1299 人非小细胞肺癌细胞 20 U-87 MG 人脑星形胶质母细胞瘤 10 U251 人胶质瘤细胞 10 A172 人胶质母细胞瘤细胞 10 K-562 人慢性髓原白血病细胞 10 HL-60 人原髓细胞白血病细胞 10 GES-1 人胃上皮细胞 20 U266 人骨髓瘤细胞 20 CAL 27 人舌鳞癌细胞 20 PC9 人肺癌细胞 5 PC14 人肺癌细胞 10 MADB-106 大鼠乳腺癌细胞 20 F98 大鼠脑胶质瘤细胞 20 MHCC-97H 人肝癌细胞(高转移) 10~20   MOI 是multiplicity of infection 的缩写,即感染复数,其含义是感染时病毒与细胞的数量比值,一般以实验中某个细胞,感染达到80%,定义为这个细胞的MOI值,即病毒量与细胞数的比值;加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000 慢病毒在肿瘤研究中的应用案例1.Nature Communications. (IF=12.353). Shi Y,et.al. (2017). Tumour-associated macrophages secrete pleiotrophin to promote PTPRZ1 signalling in glioblastoma stem cells for tumour growth.[慢病毒, 胶质细胞瘤]慢病毒干扰: Lenti-shNT/shPTN/shPTPRZ1 2. Hepatology. (IF=14.079). Ma JZ,et.al. (2016). METTL14 suppresses the metastatic potential of HCC by modulating m6 A-dependent primary miRNA processing. [慢病毒, 肝癌]慢病毒过表达/干扰:pLV-CMV-PGK-EGFP-T2A-puro/ pLV-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-puro 慢病毒在神经系统的应用(在体注射) 1.Nature Neuroscience. (IF=19.912). Ding XL,et.al. (2017). Activity-induced histone modifications govern Neurexin-1 mRNA splicing and memory preservation. [慢病毒, 学习与记忆] 病毒类型:慢病毒载体名称:LV-Suv39h1-RNAi(不确定详细的)注射部位:海马DG区病毒注射量:2 μL,9.98 × 108 TU/mL检测时间:2周2.Nature Communications. (IF=12.353). Yao XH,et.al. (2016). Electrical coupling regulates layer 1 interneuron microcircuit formation in the neocortex. [慢病毒, 神经环路] 病毒类型:慢病毒载体名称:LV- CX36-shRNA-EGFP(不确定详细的)注射部位:P1小鼠新皮层L1病毒注射量:1μL检测时间:2周3.Molecular Psychiatry. (IF=11.64). Guo DJ,et.al. (2019). Autism-like social deficit generated by Dock4 deficiency is rescued by restoration of Rac1 activity and NMDA receptor function. [慢病毒, 自闭症] 病毒类型:慢病毒载体名称:Lenti-CMV-EGFP-P2A-3FLAG-Rac1注射部位:小鼠海马CA1区病毒注射量:1μL检测时间:4周慢病毒延伸服务  和元生物慢病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程,采用三质粒或四质粒系统在293T细胞中进行包装。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化,并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。一般情况下我们的慢病毒的滴度在108~109TU/ml,完全可以满足各类实验的使用要求。

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腺病毒ADV

原文链接:和元生物——腺病毒ADV腺病毒(Adenovirus, ADV)是一种无包膜的线性双链DNA病毒,具有广泛的细胞和组织感染能力。感染过程剧烈,适于短时间内进行基因高表达的实验,与其它病毒相比,腺病毒优势在于插入片段较长,表达活性强。  体外应用时,腺病毒载体转基因效率高(接近100%的转导效率),且可转导不同类型的细胞,对于大量难转染细胞的基因递送是一个很好的工具。但是,在体内应用时,由于腺病毒免疫原性强,感染剧烈,故常会引起动物局部组织炎症反应和机体免疫反应,对动物体征和实验结果的客观性造成影响。ADV包装和侵染过程腺病毒包装与纯化  腺病毒包装骨架达质粒与穿梭质粒共转染HEK-293细胞,待细胞出现CPE状态后通过收集细胞上清和细胞裂解物,通过浓缩或氯化铯密度梯度离心纯化病毒。   CPE(Cytopathic Effect):病毒对组织培养细胞侵染后产生的细胞变性,利用此种病变效应可进行病毒定量。腺病毒滴度检测  检测方法:酶联免疫法腺病毒滴度测定,根据计算感染后染成褐色的阳性细胞数,来计算病毒滴度。       实验原理:腺病毒感染的阳性细胞表达的衣壳蛋白被染成褐色。       检测方法:免疫显色方法       实验原理:通过抗5型腺病毒外壳蛋白的单抗与待感染腺病毒样品的细胞结合,再用HRP标记的二抗与一抗结合,经显色液显色,被感染的细胞变成褐色,根据阳性细胞数,来计算病毒滴度。腺病毒载体优势       ① 表达快,腺病毒感染细胞后,1-2天即可表达       ② 载体容量大,感染效率高,常用于感染难感染的细胞       ③ 不整合到染色体中,无插入致突变性       ④  具有嗜肝性,易于感染肝细胞,腺病毒的体内应用是用于感染肝脏    不过由于腺病毒免疫原性高,对某些对外源刺激敏感的动物模型和组织中易造成炎症,体内应用需谨慎。不同病毒的生物学特性比较载体选择  和元生物拥有丰富的腺病毒产品,用于操作编码基因和非编码基因,如lncRNA、microRNA、circRNA。       以下腺病毒载体可供您选择:调控方式载体编号载体名称(载体元件顺序)真核抗性荧光启动子默认标签载体容量过表达H225pADV-mCMV-MCS-3xFLAGN/AN/AmCMV3FLAG>6kbH201pADV-mCMV-EGFP-3xFLAGN/AEGFPmCMV3FLAG>5kbH213pADV-mCMV-3xFLAG-EGFPN/AEGFPmCMV3FLAG>5kbH221pADV-mCMV-3xFLAG-P2A-EGFPN/AEGFPmCMV3FLAG>5kbH204pADV-mCMV-mCherry-HAN/AmCherrymCMVHA>5kbH222pADV-mCMV-3xFLAG-T2A-mCherryN/AmCherrymCMV3FLAG>5kbH12588pADV-EF1-mNeonGreen-CMV-MCS-3xFLAGN/AmNeonGreenCMV3FLAG>4kbH12589pADV-EF1-mScarlet-CMV-MCS-3xFLAGN/AmScarletCMV3FLAG>4kbcircRNA过表达H6946pADV-CMV-S-circRNAN/AN/ACMVN/A>5kbmiRNA过表达H216pADV-U6-miR30(miRNA)-CMV-EGFPN/AEGFPU6N/AN/A表达creK0024 pADV-CMV-CreN/AN/ACMVN/AN/A干扰DKD001pADV-U6-shRNA-CMV-EGFPN/AEGFPU6N/AN/ADKD004pADV-U6-shRNA-CMV-mCherryN/AmCherryU6N/AN/ACRISPR敲除H5064pADV-U6-spgRNA v2.0-CMV-3xFLAG-spCas9N/AN/AU63FLAGN/AH9350pADV-U6-spgRNA v2.0-CMV-sfGFP-P2A-3xFLAG-spCas9N/AsfGFPU63FLAGN/AH5066pADV-U6-spgRNA v2.0-CMV-EGFPN/AEGFPU6N/AN/AH218pADV-CMV-mCherry-P2A-3xFLAG-spCas9N/AmCherryCMV3FLAGN/AH5449pADV-CMV-mCherry-P2A-3xFLAG-eSpCas9_1.1N/AmCherryCMV3FLAGN/A应用实例  1.Hepatology. (IF=14.079). Zhou YF,et.al. (2018). Cystathionine β-synthase is required for body iron homeostasis. [腺病毒, 肝脏]  感染部位:肝脏  载体名称:Ad-CBS  注射方式:尾静脉  注射量:1 x1011 PFU/mL,10ul  检测时间:7天  2. Diabetes. (IF=8.095). Xiao Y Z,et.al. (2015). Activation of ERK1/2 ameliorates liver steatosis in leptin receptor deficient (db/db)mice via stimulating ATG7-dependent autophagy. [腺病毒, 肝脏]  感染部位:肝脏  载体名称:Ad-ATG7  注射方式:尾静脉  注射量:1 x109 PFU /只  检测时间:10天  3. Molecular Neurobiology. (IF=5.397). Guo J,et.al. (2015). Overexpression of Fibulin-5 Attenuates Ischemia/Reperfusion Injury After Middle Cerebral Artery Occlusion in Rats. [腺病毒, 大鼠]  注射部位:大鼠大脑皮层  载体名称:Ad-FBLN  注射方式:脑立体定位注射  注射量:三种不同剂量  检测时间:7天  和元生物腺病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程,采用AdEasy及Admax腺病毒包装系统在HEK-293细胞中进行包装。所获得的病毒颗粒经过超速密度梯度离心和过滤,并通过壳蛋白免疫法进行滴度测定。一般情况下腺病毒的滴度在1010~1011pfu/ml,完全可以满足各类实验的使用要求。

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逆转录病毒

原文链接:和元生物——逆转录病毒逆转录病毒(Retrovirus),又称反转录病毒,是一种RNA病毒,其两端为长末端重复序列(LTR)。该病毒呈球形,有包膜,表面有刺突,颗粒直径为100nm左右。逆转录病毒基因组有三个基因:Gag-编码病毒的核心蛋白;Pol-编码逆转录酶;Env-编码病毒的被膜糖蛋白。逆转录病毒包装及侵染细胞过程逆转录病毒包装采用三质粒或四质粒系统进行包装,收集细胞培养上清,通过超速离心浓缩纯化和收集病毒。滴度检测方法:定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。滴度检测原理:逆转录病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。逆转录病毒基因表达时,需在逆转录酶的作用下首先将RNA逆转录成DNA,形成DNA整合前复合体,随后进入细胞核随机整合到宿主细胞DNA上,经过转录、翻译,完成基因的表达。逆转录病毒包装及侵染机制逆转录病毒特点逆转录病毒的最大特点在于其特异性感染分裂期细胞,这是因为只有当被感染细胞处于细胞分裂期间,逆转录病毒DNA基因组才能接触到宿主细胞的遗传物质。不同病毒的生物学特性比较 基于上述特性,逆转录病毒适用于干细胞相关的大量研究,如神经干细胞研究、造血干细胞研究。体内应用时,逆转录病毒适用于研究成年新生神经元或胶质前体细胞的工作。逆转录病毒应用案例1、客户发表文章:Scientific Reports. (IF=4.122). Xiong Y S,et.al. (2015). Early treatment of minocycline alle-viates white matter and cognitive impairments after chronic cerebral hypoperfusion. [逆转录病毒, 卒中]注射部位:小鼠侧脑室SVZ区载体:pROV-EF1a-GFP病毒载体:逆转录病毒病毒滴度:1E+8cfu/mL注射体积:1ul2、应用案例:Nature.(IF=41.577).Yu YC,et.al. (2009).Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. [逆转录病毒, 发育]注射部位:E12-E13小鼠胚胎病毒载体:逆转录病毒注射体积:1ul

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病毒载体的改造

原文链接:和元生物——病毒载体的改造      基础研发目前的主要研究方向为慢病毒(LV)载体改造、腺病毒(ADV)容量改造、腺相关病毒(AAV)血清型筛选、特异性启动子优化、以在体应用为核心的CRISPR/Cas9技术综合开发以及其它的生物学研究工具的研发。  病毒载体是实现基因递送、完成基因操作的关键环节,因此,对病毒载体的改造在研究和应用中有着特殊的重要地位。和元研发部针对病毒载体的改造主要包括腺相关病毒的体内应用改造,包括数十种靶向特异器官血清型、多种类型的AAV血清型文库、慢病毒和腺病毒的改造。  现在研究中常用的rAAV就是利用AAV2型基因组与不同的衣壳蛋白结合产生的混合体病毒载体,一般标记为rAAV2/N (N为不同的衣壳血清型)。重组的病毒具有AAV2型的稳定表达和基因整合能力,同时获得了不同血清型的组织感染嗜亲性(不同血清型衣壳表面的特定结构位点决定了各自受体的特异性),表现出一定的器官靶向特异性。  不同血清型AAV的组织嗜亲性  血清型组织亲和性rAAV2/1神经系统(高滴度顺向跨突触),肌肉,骨骼肌,心肌,平滑肌rAAV2/2神经系统,肌肉,肝脏,血管平滑肌,眼rAAV2/3肌肉,肝脏,肺,眼rAAV2/4神经系统,肌肉,眼,脑rAAV2/5神经系统,肺,视网膜,肝脏,滑膜关节rAAV2/6神经系统,肺,肌肉,心脏rAAV2/7肌肉,肝脏rAAV2/8神经系统,肝脏,胰腺,视网膜,脂肪组织rAAV2/9神经系统,心肌,肺,视网膜,皮肤,肌肉,脂肪组织rAAV2-retro神经系统(逆向非跨突触)AAV-PHP.eB跨血脑屏障(静脉注射)AAV-PHP.S全外周神经(尾静脉注射)AAV-PAN胰腺(腹腔注射)AAV-LUNG肺(尾静脉注射)AAV-DJ视网膜,肺,肾脏,体外感染细胞AAV-7m8视网膜AAV-ShH10Y视网膜Muller细胞AAV-Rh10肝脏,血液,心脏,体外感染细胞AAV-Anc80L65内耳、视网膜、骨骼肌、肝脏AAV-SCH9SVZ区神经干细胞AAV-2M视网膜AAV-BR1脑血管内皮细胞AAV6-TM6小胶质  靶向特异器官AAV血清型感染案例  1、rAAV2-retro:神经系统(逆向非跨突触)  注射部位:小鼠BPN  注射方式:脑定位注射  载体:rAAV2-retro-hSyn-EYFP  观察时间:4周  2、AAV-PHP.eB:神经系统全脑表达(跨血脑屏障)   注射方式:尾静脉注射  载体:pAAV-CMV-mScarlet-3FLAG & pAAV-CMV-mNeonGreen-3FLAG  血清型:AAV-PHP.eB  病毒滴度:1.10×1013VG/mL & 2.35×1013 VG/mL  注射体积:200nl(注射病毒总量:1.5×1011 VG)  观察时间:3周  3、AAV-PAN:特异性感染胰腺  4、AAV-LUNG:特异性感染肺部注射方式:尾静脉注射载体:pAAV-CMV-mScarlet-3FLAG血清型:AAV-LUNG注射量: 2x1011 VG /只(滴度:1.49 x1013 VG/mL),注射体积:200 uL观察时间:3周  5、AAV-DJ体外感染293T细胞AAV-DJ(MOI=105)                            AAV8(MOI=105 )

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腺相关病毒AAV

腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)是微小病毒科(parvoviridae)家族的成员之一,是一类无法自主复制、无被膜的二十面体微小病毒,其直径约20-26nm,含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。研究中采用的重组腺相关病毒载体(recombination adeno-associated virus, rAAV)是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体,由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广(对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力)、扩散能力强、体内表达基因时间长等,rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。AAV基因组结构 rAAV包装纯化及滴度检测      AAV包装过程中,包装质粒负责编码目的基因以及两个末端反向重复序列(ITR,对于病毒的复制和包装具有决定性作用),辅助质粒包含AAV包装所需的cap(编码病毒衣壳蛋白)和rep(参与病毒的复制)基因,以及腺病毒Helper质粒。三种质粒共同转染293T细胞后,AAV病毒开始复制和包装。和元生物腺相关病毒的生产和质控采取了国际学术界公认的标准流程,采用三质粒系统在293T细胞中进行包装。所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化,并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。另外,我们也可以根据使用者要求,提供蛋白染色检测衣壳蛋白的完整性以及内毒素含量等。一般情况下rAAV的滴度在1012~1013 VG/ml,完全可以满足各类整体实验的使用要求。AAV包装流程图滴度检测方法:定量PCR检测病毒基因组中外源DNA拷贝数。滴度检测原理:腺相关病毒的基因组为单链DNA,外源DNA拷贝数代表病毒基因组拷贝数。rAAV侵染细胞过程    纯化后的AAV病毒载体可以用于侵染细胞,侵染细胞时,AAV与细胞表面特异性受体结合,激活胞内信号通路,进而触发AAV通过受体介导的内吞作用进入细胞,在核内体、高尔基体等细胞器的协助下进入细胞核,随后病毒裂解,其单链DNA需复制成为双链DNA后表达目的基因。rAAV作用机制rAAV载体优势1、安全性高、免疫原性低:AAV是一种复制缺陷型DNA病毒,无自主复制能力,野生型AAV依赖rep基因进行低频定点整合,rAAV不整合。目前尚无由AAV引起的人类及哺乳动物疾病报道,也是FDA批准上市的基因治疗药物中最安全的病毒载体之一。2、宿主细胞范围广:AAV具有广泛的宿主范围,对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。3、扩散能力强:AAV直径约20-26nm,体积小,滴度高,具有良好的扩散能力,其中AAV-PHP.eB和AAV9具有跨血脑屏障的能力,在神经科学领域应用广泛。4、体内表达基因时间长:AAV具有保持长期基因转录表达能力,体内表达一般3周可以达到高峰,随后持续高表达,作用时间>5个月。5、种类多样:AAV血清型众多,此外,根据不同的实验设计,我们还在不断的突变,筛选新的血清型(AAV1-13,AAV2/1, 2/2, 2/5, 2/6, 2/8, 2/9, DJ; retro, PHP.eB…)。不同病毒的生物学特性比较基于上述特点,AAV被视为是一种高效和安全的体外及体内基因转导工具。尤其在整体水平研究中,与其他常用病毒工具载体相比,AAV具有感染过程温和长效的表达能力,是基因操作的利器。rAAV血清型选择      目前已注册的AAV种类总数已超过196种,灵长类动物体内有13种不同血清型的AAV(即AAV1-AAV13),其中AAV2、AAV3、AAV9源自人类本身,值得注意的是,AAV2是最早被克隆的病毒,也是迄今研究最为彻底、应用最为广泛的病毒载体。随着研究的不断深入,研究人员发现不同血清型的AAV之间可以杂交,而杂交后的AAV会兼有杂合双方的特点,因此,AAV亚型顺势诞生。     现在研究中常用的rAAV就是利用AAV2型基因组与不同的衣壳蛋白结合产生的混合体病毒载体,一般标记为rAAV2/N (N为不同的衣壳血清型)。重组的病毒具有AAV2型的稳定表达和基因整合能力,同时获得了不同血清型的组织感染嗜亲性(不同血清型衣壳表面的特定结构位点决定了各自受体的特异性),表现出一定的器官靶向特异性。不同血清型AAV的组织嗜亲性血清型组织亲和性rAAV2/1神经系统(高滴度顺向跨突触),肌肉,骨骼肌,心肌,平滑肌rAAV2/2视网膜、神经系统,肌肉,肝脏,血管平滑肌rAAV2/3肌肉,肝脏,肺,眼rAAV2/4神经系统,肌肉,眼,脑rAAV2/5神经系统,肺,视网膜,肝脏,滑膜关节rAAV2/6神经系统,肺,肌肉,心脏rAAV2/7肌肉,肝脏rAAV2/8神经系统,肝脏,肌肉,脂肪组织,胰腺,视网膜,rAAV2/9神经系统,心肌,肺,视网膜,皮肤rAAV2-retro神经系统(逆向非跨突触)AAV-PHP.eB跨血脑屏障(静脉注射)AAV-PHP.S全外周神经(尾静脉注射)AAV-PAN胰腺(腹腔注射)AAV-LUNG肺(尾静脉注射)AAV-DJ视网膜,肺,肾脏,体外感染细胞AAV-7m8视网膜AAV-ShH10Y视网膜Muller细胞AAV-Rh10肝脏,血液,心脏,体外感染细胞AAV-Anc80L65内耳、视网膜、骨骼肌、肝脏AAV-SCH9SVZ区神经干细胞      小建议:如您不确定选择哪种血清型,可尝试使用和元生物Pandora’s Virus (AAV多种血清型)进行预实验,通过比较不同血清型对目标组织的感染效果,摸索最佳实验条件(注射方法、注射位点、病毒用量等),以便得到更理想的实验结果。      Pandora’s Virus 详情: rAAV载体应用案例1、在神经科学领域中的应用1.1 外侧缰核&光遗传学客户发表文章:Nature. (IF=41.577). Yang Y,et.al. (2018). Ketamine blocks bursting in the lateral habenula to rapidly relieve depression. [腺相关病毒, 抑郁症, 光遗传]注射部位:小鼠LHb载体:AAV2/9-hSyn-oChIEF-tdTomato血清型:AAV2/9病毒滴度:6.29E+12 VG/mL注射体积:100nl观察时间:1个月1.2 臂旁核&化学遗传学客户发表文章:Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相关病毒, 痒, 光遗传,化学遗传]注射部位:小鼠PBN载体:AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine血清型:AAV2/9病毒滴度:1E+13 VG/mL注射体积:150nl观察时间:3周1.3 丘脑&钙离子成像客户发表文章:客户发表文章:Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺相关病毒, 觉醒]注射部位:小鼠PVT载体:AAV-CaMKIIα-GCaMP6f注射体积:100nl观察时间:4周1.4 丘脑室旁核&杀死神经元客户发表文章:Science. (IF=41.058). Ren S,et.al. (2018). The paraventricular thalamus is a critical thalamic area for wakefulness. [腺相关病毒, 觉醒]注射部位:小鼠PVT载体:AAV-CaMKIIα-Cre-GFP &AAV-DIO-caspase-3注射体积:两支病毒1:1混合注射100nl观察时间:4周1.5 海马、皮层&逆向非跨突触(rAAV2/retro)客户发表文章:Biological Psychiatry. (IF=11.984). Bing Xing Pan,et.al. (2018). Chronic stress causes projection-specific adaptation of amygdala neurons via SK channel downregulation. [腺相关病毒, 焦虑症, 光遗传]注射部位:小鼠dmPFC、VHPC载体:AAV2/1-retro-Syn-eYFP-Cre、AAV2/8-CaMKIIα-DO-SK2&AAV2/8-CaMKIIα-DIO-SK2-mCherry注射体积:300nl观察时间:4周1.6 初级运动皮层&顺向跨突触(rAAV2/1)Nature Neuroscience. (IF=19.912). Yao J,et.al. (2018). A corticopontine circuit for initiation of urination. [腺相关病毒, 神经环路]注射部位:小鼠皮层M1、PMC载体:rAAV2/1-hSyn-Cre&rAAV2/9-DIO-hChR2(H134R)-mCherry、rAAV2/9-DIO-GCaMP6s病毒滴度:rAAV2/1: 5E+12 VG/mL;rAAV2/9-DIO-hChR2:1.2E+13 VG/mL;rAAV2/9-DIO-GCaMP6s:1E+12 VG/mL注射体积:多点注射,每位点30-40nl观察时间:4周1.7 边缘前皮质&跨突触示踪(WGA-Cre)客户发表文章:Science Advances. (IF=11.511). Ping Zheng,et.al. (2019). Crucial role of feedback signals from prelimbic cortex to basolateral amygdala in the retrieval of morphine withdrawal memory. [腺相关病毒, 成瘾, AAV1, AAV-WGA-Cre]注射部位:小鼠PrL载体:AAV-hSyn-mCherry-IRES-WGA-Cre病毒滴度:4.28E+12 VG/mL注射体积:300nl观察时间:4周1.8 皮层&AAV干扰(AAV-shRNA)客户发表文章:Nature Medicine. (IF=22.864). Cao X,et.al. (2013). Astrocyte-derived ATP modulates depressive-like behaviors.[腺相关病毒, 抑郁症]注射部位:小鼠mPFC载体:AAV-CMV-P2rx2 shRNA-EGFP病毒滴度:3E+12 VG/mL注射体积:1.5ul观察时间:2周1.9 全脑表达&跨血脑屏障(AAV-PHP.eB)和元生物—rAAV-PHP.eB尾静脉注射感染全脑实例病毒总量:1.5E+11VG注射体积:200ul病毒表达时间:四周1.10稀疏标记应用文献:Luo WS, et al., (2016) Supernova: A Versatile Vector System for Single Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci Rep.载体信息:pAAV-PTRE-tight-NLS-Cre(108-109VG/mL)、pAAV-EF1a-DIO(tTA-P2A-mScarlet)-WPRE(1012VG/mL)1.11在视网膜中的应用和元生物—玻璃体腔注射病毒载体:AAV-syn-GcaMP6s2、在其他脏器中的应用2.1 rAAV感染肝脏和元生物—rAAV2/8尾静脉注射感染肝脏实例病毒总量:1E+11VG注射体积:200ul病毒表达时间:四周2.2 rAAV感染心脏和元生物—rAAV2/9尾静脉注射感染心脏实例病毒总量:2E+11VG注射体积:200ul病毒表达时间:四周2.3 rAAV感染肺部 和元生物—rAAV-Lung尾静脉注射感染肺部实例病毒总量:5E+11VG注射体积:200ul病毒表达时间:二周客户发表文章:Cell. (IF=36.216). Huijuan Wu,et.al. (2020). Progressive Pulmonary Fibrosis Is Caused by Elevated Mechanical Tension on Alveolar Stem Cells. [腺相关病毒, 干扰]注射方式:气管注射感染部位:肺部载体:pAAV-Tgfb1 shRNA血清型:rAAV2/9病毒注射量:1E+11 VG(50ul)观察时间:3周2.4 rAAV感染肾脏和元生物—rAAV2/8尾静脉注射感染肾脏实例病毒总量:2E+11VG注射体积:200ul病毒表达时间:四周2.5 rAAV感染脂肪组织和元生物—rAAV2/8腹股沟脂肪多点注射感染脂肪实例病毒总量:4E+10VG/侧病毒表达时间:四周2.6 rAAV感染肌肉组织和元生物—rAAV2/8后腿肌肉多点注射感染肌肉实例病毒总量:4E+10/侧病毒表达时间:四周2.7 rAAV感染胰腺和元生物—rAAV-PAN腹腔注射胰腺实例病毒总量:4E+11VG表达检测时间:4周原文链接:和元生物——腺相关病毒AAV

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质粒构建

  和元生物科研服务平台可为基因功能研究者提供前沿、全面、严谨的载体设计和载体构建服务,内容涵盖普通真核表达载体、病毒载体等。  病毒载体构建服务包含慢病毒、腺相关病毒、腺病毒和逆转录病毒载体等,构建内容包括基因过表达载体构建、基因定点突变表达载体构建、用于基因沉默的shRNA设计与构建、microRNA表达与封闭载体设计与构建、萤光素酶报告基因载体构建(UTR、启动子及其它功能序列)以及Cre-LoxP系统和CRISPR/Cas9基因编辑工具载体设计与构建等,力求一站式解决基因功能研究中的基因上调和基因下调需求。  质粒优势:  ①表达时间快,导入细胞后约24小时可观察到目的基因表达;  ②构建技术简单,成本低。  ③和元的过表达载体库丰富,并且过表达的标记丰富  荧光标记:GFP、mCherry、CFP、BFP、EYFP、mNeonGreen、tdTomato、 mScarlet…  标签标记: FLAG、 HA 、Myc、His tag…  抗性标记:Puro、Neo、Hygro、BSD…  局限性:  ①转染试剂具有细胞毒性,使用后影响细胞状态;  ②大部分细胞较难转染,达不到基因操作目的;  ③质粒不整合到细胞基因组,只能进行短时间的瞬时表达,无法进行观察周期较长的实验。  由于单纯质粒存在一定的局限性,根据实验需要需包成病毒进一步满足不同实验的需求。  不同表达载体的区别表达系统真核表达载体慢病毒载体重组腺相关病毒载体重组腺病毒载体载体基因特性双链DNA质粒RNA逆转录病毒单链DNA病毒双链DNA病毒外源基因表达时间24h开始表达,持续3-7天2-4天开始表达,长时间稳定表达7-14天开始表达1-2天开始表达插入片段大小8kb左右4kb左右2.8kb左右6kb左右稳定细胞株筛选难操作可以不可以不可以,瞬时表达细胞实验细胞系,部分转染效率低首选,广谱,感染效率高不适合广谱,感染效率高动物实验不适合适合,根据观察时间和注射部位首选,根据观察时间和注射部位免疫原性高,慎选滴度范围无108~109TU/ml1012-1013vg/ml1010-1011pfu/ml原文链接:和元生物——质粒构建

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基因过表达

原文链接:和元生物——基因过表达基因功能研究中通常需要上调目的基因的表达来观察表型的变化。过表达是将目的基因在宿主细胞大量表达的过程,其基本原理是将目的基因构建到工具载体上,导入细胞使基因实现大量转录和翻译,从而实现基因产物的过表达。工具载体通常包括原核表达载体、普通真核表达载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体等。工具载体介绍根据实验需要不同,目的基因大小等选择不同的载体,包括真核表达载体和病毒载体等均可以实现编码基因和非编码基因的过表达。表达系统真核表达载体慢病毒载体重组腺相关病毒载体重组腺病毒载体载体基因特性双链DNA质粒RNA逆转录病毒单链DNA病毒双链DNA病毒外源基因表达时间24h开始表达,持续3-7天2-4天开始表达,长时间稳定表达7-14天开始表达1-2天开始表达插入片段大小8kb左右4kb左右2.8kb左右4kb左右稳定细胞株筛选难操作可以不可以不可以,瞬时表达细胞实验细胞系,部分转染效率低首选,广谱,感染效率高细胞系,部分血清型转染效率低广谱,感染效率高动物实验不适合适合,根据观察时间和注射部位首选,根据观察时间和注射部位免疫原性高,慎选滴度范围无108~109TU/ml1012-1013VG/ml1010-1011PFU/ml载体图谱中常见元件介绍元件名称类型用途启动子CMV、CAG、EF1a、U6等广谱或特异启动目的基因的表达hSyn、CaMKIIα等特异性启动子,在特定的组织细胞中启动目的基因的表达蛋白标签3xFLAG、HA 、6xHis、Myc等与目的基因融合表达,常用于检测外源蛋白表达水平荧光标记EGFP、mCherry、mNeonGreen等可与目的基因融合或非融合表达用于检测转染、感染效果抗性基因Puro、Neo、Hygro、BSD等真核抗性,常用于稳定株筛选Amp、Kan原核抗性,常用于原核细菌培养,质粒扩增连接元件Linker用于连接两个基因,融合表达时常用,可降低因融合表达对蛋白折叠和功能的影响IRES、2A用于连接两个基因,达到非融合表达的效果其它元件WPRE增加目的基因的表达载体选择(部分)病毒载体的选择,根据实验的需求参考慢病毒、腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒等。载体类别编号载体元件慢病毒过表达GL127pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAG-WPREGL121pSLenti-EF1-EGFP-CMV-MCS-WPREGL107pSLenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3xFLAG-WPREGL122pSLenti-EF1-EGFP-F2A-BSR-CMV-MCS-WPREGL124pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE腺病毒过表达H225 pADV-mCMV-MCS-3xFLAGH201pADV-mCMV-EGFP-3xFLAGH213pADV-mCMV-3xFLAG-EGFPH204pADV-mCMV-mCherry-HA腺相关病毒过表达AOV024pAAV-CMV-EGFP-P2A-3xFLAG-WPREAOV025pAAV-CMV-mCherry-P2A-3xFLAG-WPREAOV064pAAV-hSyn-EGFP-P2A-3xFLAG-WPREAOV065AAV-hSyn-mCherry-P2A-3xFLAG-WPREH9429pAAV-CAG-EGFP-3xFLAG-tWPAH9525pAAV-CMV-EGFP-3xFLAG-tWPAH10881pAAV-CAG-EGFP-3xFLAG-tWPAH10886pAAV-CMV-EGFP-3xFLAG-tWPA服务简介根据客户提供的基因信息,从生物信息学网站上调出该基因的cDNA序列,将cDNA序列构建到工具载体中,根据实验需求过表达编码基因或者非编码基因。针对病毒载体,包装生产的病毒颗粒可以直接用于感染细胞或者动物实验。病毒载体服务流程

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CRISPR/Cas9

原文链接:和元生物——CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9 是一种能够对基因组的特定位点进行精确编辑的技术。其原理是核酸内切酶Cas9蛋白通过导向性RNA(guide RNA, gRNA)识别特定基因组位点并对双链DNA进行切割,造成DNA双链断裂,细胞利用非同源末端连接(Non homologous End Joining,NHEJ)或者同源重组(Homologous Recombination, HR)方式对切割位点进行修复,实现DNA水平基因敲除或精确编辑。CRISPR/Cas9系统主要由两部分组成:1. 单链的guide RNA(single-guide RNA,sgRNA)2. 有核酸内切酶活性的Cas9 蛋白CRISPR基因敲除以基因敲除为目的时,可以利用Cas9-sgRNA对DNA进行切割产生双链断裂,随后细胞通过非同源末端连接方式修复DNA,在此过程中,将随机引入碱基的缺失或增加,基因发生移码突变,导致编码基因的敲除。  CRISPR基因编辑  以基因敲入或替换为目的时,需要借助同源重组原理。CRISPR/Cas9系统中的Cas9-sgRNA在靶位点进行切割产生DNA双链断裂,在模板DNA存在时,细胞通过同源重组方式修复DNA,而模板DNA可以被人为设计成需要插入的基因或需要修复的基因,此时细胞编码目的基因。载体的选择(部分)提供病毒载体的含Cas9蛋白的单载和双载系统,可根据目的基因序列设计多条gRNA,载体带有多种荧光抗性标记,方便筛选。载体类别编号载体元件CRISPR慢病毒单载体H5070pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-spCas9-WPREH7072pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-BSR-P2A-3xFLAG-spCas9-WPREH6825pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-sfGFP-P2A-3xFLAG-spCas9-WPRECRISPR慢病毒双载体H5068pLenti-U6-spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPREH5450pLenti-CMV-Puro-P2A-3xFLAG-espCas9_1.1-WPRECRISPR  AAV单载体系统H6941pAAV-CMV-SaCas9-U6-sagRNA v2.0H5273pAAV-hSyn-SaCas9-U6-sagRNA v2.0CRISPR  AAV双载体系统H6291pAAV-CMV-EGFP-WPRE-U6-spgRNA v2.0H12663pAAV-U6-shRNA/spgRNA v2.0-CMV-EGFP-WPREH11012pAAV-CMV-Luc2-WPRE-U6-spgRNA病毒载体服务流程

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环路示踪

原文链接:和元生物——环路示踪  神经元之间的环路连接非常复杂,完整而准确地显示这些环路的结构和变化,对揭示许多疾病的病因和新治疗方法的开发具有非常重要的意义。  传统的神经示踪方法如电镜、Golgi染色、染料、肽类标记物等可以显示神经元的形态和投射,少数示踪剂如WGA、TTC等还可以实现跨突触标记,但这些方法都具有信号间接、方向不特异、跨突触后信号衰减严重等缺点,最重要的是,这些染料无法携带基因,因此只能显色。自20世纪80年代,Kristensson首次应用单纯疱疹病毒(HSV)跨突触标记神经元后,各种各样病毒载体在环路示踪方面的应用越来越受到重视。  但需要注意的是,虽然这类嗜神经病毒对于神经环路的标记具有很强的感染性和特异性,但其免疫原性很强,动物往往在注射后数天死亡,无法进行行为测试或者生理研究,目前更适用于寻找未知的神经环路,此外此类病毒需要PII以上等级的实验室。因此,越来越多的研究使用AAV进行环路示踪标记。由于AAV本身无复制能力,且其免疫原性极低,因而其不会造成大量的毒害,亦不会影响动物的正常生理,故AAV成为最常用的环路示踪工具病毒载体。  神经元是具有极性的细胞,信息从上一级神经元的轴突通过突触传递到下一级神经元的树突,之后发生树突、胞体的信息整合,并通过轴突再次发出。因此涉及神经环路的标记包括方向性(顺向:胞体至轴突的标记;逆向:轴突至胞体的标记)和是否跨突触两大基本问题(图1)。  图1 神经环路示踪技术的目标(改自Peter L Strick, et al., eLS, 2011)  环路示踪应用案例  1、基于AAV的顺向非跨突触标记  ① 客户发表文章:Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相关病毒, 痒, 光遗传,化学遗传]  注射部位:小鼠PBN  载体:AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine  血清型:AAV2/9  病毒滴度:1.0× 1013 VG/mL  注射体积:150nl  观察时间:3周  ② 客户发表文章:Neuron. (IF=14.319). Tian-Le Xu,et.al. (2019). Central Processing of Itch in the Midbrain Reward Center. [AAV,痒,光遗传学]  注射部位:Vgat- Cre小鼠VTA  载体:AAV-EF1a-DIO-ChR2(H134R)-mCherry  血清型:AAV2/8  病毒滴度:7.39×1012 VG/mL  注射体积:300-400nl  观察时间:2-3周  2、基于AAV的逆向非跨突触标记—rAAV2-retro  ① 客户发表文章:Biological Psychiatry. (IF=11.984). Bing Xing Pan,et.al. (2018). Chronic stress causes projection-specific adaptation of amygdala neurons via SK channel downregulation. [腺相关病毒, 焦虑症, 光遗传]  注射部位:小鼠dmPFC、VHPC  载体:AAV2/1-retro-Syn-eYFP-Cre、AAV2/8-CaMKIIα-DO-SK2&AAV2/8-CaMKIIα-DIO-SK2-mCherry  注射体积:300nl  观察时间:4周  ② 内部测试结果  注射部位:小鼠BPN  载体:rAAV2-retro-hSyn-EYFP  观察时间:4周  3、基于AAV的跨突触标记  3.1 基于AAV的顺向跨突触标记-- rAAV2/1  ① 客户发表文章:Nature Neuroscience. (IF=19.912). Yao J,et.al. (2018). A corticopontine circuit for initiation of urination. [腺相关病毒, 神经环路]  注射部位:小鼠皮层M1、PMC  载体:rAAV2/1-hSyn-Cre&rAAV2/9-DIO-hChR2(H134R)-mCherry、rAAV2/9-DIO-GCaMP6s  病毒滴度:rAAV2/1: 5 × 1012 VG/mL;rAAV2/9-DIO-hChR2:1.2 × 1013 VG/mL;rAAV2/9-DIO-GCaMP6s:0.5 × 1012 VG/mL  注射体积:多点注射,每位点30-40nl  观察时间:4周  ② 客户发表文章:Science Advances. (IF=11.511). Ping Zheng,et.al. (2019). Crucial role of feedback signals from prelimbic cortex to basolateral amygdala in the retrieval of morphine withdrawal memory. [腺相关病毒, 成瘾, AAV1, AAV-WGA-Cre]  注射部位:小鼠皮层BLA  载体:rAAV2/1-hSyn-Cre-EGFP  病毒滴度: 1.13 × 1013 VG/mL  注射体积:60nl  观察时间:5周  3.2 借助WGA的跨突触标记—AAV-WGA-Cre  客户发表文章:Science Advances. (IF=11.511). Ping Zheng,et.al. (2019). Crucial role of feedback signals from prelimbic cortex to basolateral amygdala in the retrieval of morphine withdrawal memory. [腺相关病毒, 成瘾, AAV1, AAV-WGA-Cre]  注射部位:小鼠PrL  载体:AAV-hSyn-mCherry-IRES-WGA-Cre  病毒滴度:4.28 × 1012 VG/mL  注射体积:300nl  观察时间:4周

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启动子优化

原文链接:和元生物——启动子优化  基础研发目前的主要研究方向为慢病毒(LV)载体改造、腺相关病毒(AAV)血清型筛选、特异性启动子优化、以在体应用为核心的CRISPR/CAS技术综合开发以及其它最新的生物学研究工具的研发。  病毒载体的启动子元件决定了病毒表达的特异性,为了靶向性研究或基因治疗,我们需要不断开发适合特异性细胞或组织的启动子,并不断优化。目前,和元基础研发部着重针对不同组织或器官中的特定细胞进行启动子优化、筛选,同时也欢迎启动子研发合作项目。常用启动子列表CAG/CBG/CMV/EF1a常用广谱启动子GFAP星形胶质细胞(长启动子)hSyn成熟神经元shortGFAP星形胶质细胞(短启动子)CaMKIIα投射神经元GfaABC1D星形胶质细胞GAD67GABA能中间神经元Iba1/CX3CR1小胶质细胞mDLxGABA能中间神经元MBP少突胶质细胞fPVPV+中间神经元NG2/NGL2少突胶质细胞前体细胞fNPYNPY+中间神经元TH儿茶酚胺能神经元(DA、NE、E)fSSTSST+中间神经元PRSx8去甲肾上腺素能神经元DAT多巴胺能神经元ChAT胆碱能神经元L7pcp2小脑蒲肯野细胞D1/D2多巴胺D1/D2受体神经元FEV五羟色胺能神经元HCRT下丘脑食欲素神经元cTNT心肌细胞TBG肝脏  特异性启动子感染案例   AAV8-TGB-Fabp1[1](TGB肝脏特异性启动子)  AAV-CaMKIIα-NpHR-EYFP[2](CaMKIIα投射神经元特异性启动子)  AAV-Syn-CAPON-L-GFP[3](Syn成熟神经元特异性启动子)  AAV-GFAP- AAV–Ascl1/mCherry [4](GFAP星形胶质细胞特异性启动子)  参考文献:  [1] Pi H. et al., (2019) Long-term exercise prevents hepatic steatosis: a novel role of FABP1 in regulation of autophagy-lysosomal machinery. FASEB J. doi: 10.1096/fj.201900812R.  [2] Li YD, et al., (2017) A distinct entorhinal cortex to hippo-campal CA1 direct circuit for olfactory associative learning. Nature Neuroscience.  [3] Zhu L J, et al., (2014) CAPON-nNOS coupling can serve as a target for developing new anxiolytics. Nature Medicine.  [4] Liu Y G, et al., (2015) Ascl1 Converts Dorsal Midbrain Astrocytes into Functional Neurons In Vivo. J. Neuroscience.

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疾病研究

原文链接:和元生物——疾病研究  基于对病毒载体的深入了解和研发,越来越多的科研人员开始借助病毒载体进行疾病研究。目前,病毒载体工具在不同组织器官中均有大量的应用,通过使用工具病毒载体,对疾病相关基因进行定向和组织特异性的改造和操控,已成为科研人员进行疾病研究与治疗的一种技术手段。  病毒载体的选择  不同病毒载体的大小迥异,意味着其内含基因容量存在巨大差异;免疫原性的不同,意味着其体内/体外应用的场景需要细微调整;表达时间和周期的不同,意味着我们需要根据研究需求进行相对应的选择。表1 不同病毒的生物学特性比较慢病毒腺相关病毒腺病毒逆转录病毒包膜有无有有颗粒直径80-100 nm20-30 nm90-100nm~100nm基因组dsRNAssDNAdsDNARNA基因组大小9.75kb4.7kb36kb~5kb表达起始时间48-72h72-96h24-48h48-72h表达持续时间> 2 months> 6 months< 1 month> 2 months体内扩散能力一般强强一般免疫原性中等极低强中等滴度范围108~109TU/mL1012-1013VG/mL1011-1012PFU/mL107~108TU/mL滴度检测方法qPCR整合DNAqPCR非整合DNA抗原抗体免疫染色试剂盒qPCR整合DNA整合方式随机高频整合定向低频整合(rAAV不整合)非整合随机整合应用范围体外细胞感染,gRNA文库筛选,体内基于不同的血清型,体内广泛应用嗜肝,快速表达或短期表达,血液、心脏,细胞系等 特异性只感染分裂期的细胞  重组腺相关病毒载体(rAAV),一直是体内研究的明星载体,除了其免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广、扩散能力强、体内表达基因时间长等优势外,还在于其种类多样性。  现在研究中常用的rAAV就是利用AAV2型基因组与不同的衣壳蛋白结合产生的混合体病毒载体,一般标记为rAAV2/N (N为不同的衣壳血清型)。重组的病毒具有AAV2型的稳定表达和基因整合能力,同时获得了不同血清型的组织感染嗜亲性,表现出一定的器官靶向特异性。表2 不同血清型AAV的组织嗜亲性血清型组织亲和性rAAV2/1神经系统(高滴度顺向跨突触),肌肉,骨骼肌,心肌,平滑肌rAAV2/2神经系统,肌肉,肝脏,血管平滑肌,眼rAAV2/3肌肉,肝脏,肺,眼rAAV2/4神经系统,肌肉,眼,脑rAAV2/5神经系统,肺,视网膜,肝脏,滑膜关节rAAV2/6神经系统,肺,肌肉,心脏rAAV2/7肌肉,肝脏rAAV2/8神经系统,肝脏,胰腺,视网膜,脂肪组织rAAV2/9神经系统,心肌,肺,视网膜,皮肤,肌肉,脂肪组织rAAV2-retro神经系统(逆向非跨突触)AAV-PHP.eB跨血脑屏障(静脉注射)AAV-PHP.S全外周神经(尾静脉注射)AAV-PAN胰腺(腹腔注射)AAV-LUNG肺(尾静脉注射)AAV-DJ视网膜,肺,肾脏,体外感染细胞AAV-7m8视网膜AAV-ShH10Y视网膜Muller细胞AAV-Rh10肝脏,血液,心脏,体外感染细胞AAV-Anc80L65内耳、视网膜、骨骼肌、肝脏AAV-SCH9SVZ区神经干细胞   小建议:如您不确定选择哪种血清型,可尝试使用和元生物Pandora’s Virus (AAV试用装)进行预实验,通过比较不同血清型对目标组织的感染效果,摸索最佳实验条件(注射方法、注射位点、病毒用量等),以便得到更理想的实验结果。(链接到Pandora’s Virus>>)肝脏  肝脏是调控机体脂质代谢、血糖代谢的重要器官,其功能异常会导致脂肪肝、高胆固醇血症、高血脂症、糖尿病等疾病。  1、注射方式  应用病毒载体感染肝脏一般采用尾静脉注射的方式。  按照和元生物多年的经验,使用AAV载体感染肝脏组织一般选取AAV2/8血清型,通过尾静脉注射手段感染肝脏每只小鼠需要注射1x1010总滴度的病毒载体。    和元生物AAV感染结果  2、应用案例  2.1 肝脏特异启动子TGB  客户发表文章:FASEB Journal. (IF=5.391). Yang Y,et.al. (2018). Long-term exercise prevents hepatic steatosis: a novel role of FABP1 in regulation of autophagy-lysosomal machinery. [非酒精性脂肪肝,自噬溶酶体,腺相关病毒过表达]  注射方式:小鼠尾静脉注射  载体:AAV8-TGB-Fabp1  血清型:rAAV2/8  注射量:200ul,2× 1011 VG  观察时间:1周  2.2 Cre-loxp技术在小鼠肝脏中的应用  由于腺病毒高度嗜肝,几乎90%以上会感染肝脏,因此腺病毒可以作为肝脏特异性感染的有效载体。将Cre腺病毒(Ad-Cre)通过尾静脉注射入带有loxp小鼠体内,即可实现肝脏特异性表达并将目的基因敲除,从而快速获取肝脏特异性基因敲除小鼠。  2.3 CRISPR/Cas9技术在小鼠肝脏中的应用  通过腺病毒将CRISPR/Cas9系统相关元件(Cas9和sgRNA)注射入小鼠体内,可以实现在肝脏中特异性表达,并实现肝脏部位的特异性敲除。此方法比较适合检验活体实验。胰腺  胰腺是一个兼有内、外分泌功能的器官,与机体消化、血糖代谢、脂质代谢等有密切的关系,也是代谢研究的关键目标器官之一。  在实际研究中,使用病毒载体感染胰腺主要有两种方式,一种是使用AAV2/8病毒载体,通过胆管将病毒注射入胰腺;另一种新方法是使用和元生物新研发的AAV-PAN病毒载体,腹腔注射感染胰腺:和元生物AAV-PAN感染结果心脏  1、注射方式  AAV的注射方式,不同的文章中采用了不一样的注射方式。总体上,一般包括静脉注射、心腔内注射、心肌内定点注射、心包内注射(介于心肌与心包膜之间),其中静脉注射包括尾静脉注射、颈静脉注射、面部静脉注射等。  尾静脉注射和心腔内注射由于病毒流进血液循环,分布较均匀。心腔内注射需要结合主动脉嵌夹进行,由于开胸腔手术需要辅助呼吸,对手术操作要求较高。心肌内定点注射时每点注射2-5ul,效果是在注射的局部点附近表达较高,但扩散非常有限。总的来说,很多实验直接用尾静脉注射即可,但是可能需要较高剂量的病毒,如果用心肌内定点注射,即小量多点注射,可以达到很好的感染表达效果,但是后者操作技术难度略高,也需要花费更长的操作时间。  结合新生鼠(出生2-10天)注射效果比较来看,新生鼠注射表达效果大大优于成年鼠,消耗病毒剂量也相对较低。新生鼠的注射,一般根据实验室的条件来看,可以选择颈静脉注射、面部静脉注射和心腔内(左心室)注射,目的是将病毒导入血液循环中。  2、启动子选择  一些常用启动子如CMV、CAG、αMHC、cTnC等常被用于驱动在心脏组织中的表达。很多高效的启动子由于片段较大,如αMHC,仅用于转基因小鼠等实验,不适合装载在AAV载体上。通过查阅文献,我们发现一些小的启动子如CMV在心脏组织的表达能力比较强,特别对于大片段的驱动效果很明显,但是如果需要介导的目的基因在心脏中特异性表达,则推荐使用cTnT启动子,cTnT常被用于心肌的特异性表达,表达能力也很强。  3、应用案例  3.1 心脏特异性启动子cTNT  客户发表文章:Yue Z, et al., (2019) PDGFR-b Signaling Regulates Cardiomyocyte Proliferation and Myocardial Regeneration. Cell Rep.  注射方式:  载体:AAV9  血清型:rAAV2/9  启动子:cTnT  注射量:200ul,2× 1011 VG  观察时间:1周  3.2 Cas9心脏特异性转基因小鼠  科学家构建了带有eSpCas9(1.1)的心脏特异性转基因小鼠,通过Myh6基因的启动子(αMHC)驱动Cas9在心肌的特异性表达。αMHC启动子是心脏特异性转基因小鼠常用启动子。这个工具小鼠能够解决实验过程中Cas9在心脏递送和表达的难题。转基因小鼠可以维持Cas9在心脏长期高水平的表达,而这个正是CRISPR/Cas9系统在心脏部位编辑效率不高的症结所在。    Cas9转基因小鼠,只需要通过AAV递送sgRNA到心脏表达即可实现,这种方法可以获得比较高的编辑效率。研究人员将靶向Myh6基因外显子sgRNA通过装载在AAV载体上注射入小鼠,实现心脏特异性敲除。Myh6表达水平降低50%以上,同时成功得到发生心肌肥厚和扩张型心脏的突变小鼠。肺部  目前对于肺部的病毒感染,普遍采用AAV病毒载体,使用病毒载体感染胰腺主要有两种方式,一种是使用AAV2/9病毒载体,通过鼻内或气管内递送(经呼吸道)将病毒通过肺呼吸道递送,参考剂量是1×1011VG病毒,体积50ul;另一种新方法是使用和元生物新研发的AAV-LUNG病毒载体,尾静脉注射特异性感染肺部:    和元AAV-LUNG感染肺部结果肌肉  目前,对于肌肉组织中使用的病毒载体通常会选用AAV病毒载体,因为AAV不仅能够高效特异地靶向肌肉组织,且能在肌肉组织中表达持久。腺病毒使用时容易引起较强的免疫反应,并且很容易被清除,表达时间比较短暂,较少被应用于肌肉组织的靶向表达。尽管慢病毒感染表达范围广泛,对培养的肌肉细胞均能高效表达,但是对肌肉组织的感染表达非常有限。目前靶向肌肉的AAV载体血清型主要为AAV1,AAV6和AAV9。其中,AAV9的表达效率最高,并且更容易在肌肉中高表达。  1、注射方式  应用病毒载体感染肌肉组织进行研究,一般分为系统注射和肌肉内注射,系统注射表达较均匀,但是大部分病毒会被其他脏器组织吸收,导致靶向肌肉的病毒较少。肌肉内注射是一种定点注射,可以在注射点附近高效表达,但缺点是病毒扩散十分有限,因此往往需要多点注射,一般每个点在5-10ul。  2、应用案例    注射方式:静脉注射  载体:AAV-CMV-miniDystrophin  血清型:rAAV2/9  观察时间:16周脂肪组织  脂肪组织由大量脂肪细胞组成,分为白色脂肪、棕色脂肪和米色脂肪组织,脂肪组织是机体冗余能量储存的重要器官,同时也是重要的分泌器官,在机体的血糖代谢、脂质代谢、慢性炎症、伤疤修复等中有重要的生理功能。  研究中,如果我们使用病毒载体感染脂肪组织,一般采用定点注射的方式。使用AAV病毒载体感染脂肪组织一般选取rAAV2/8血清型,在脂肪组织的多点注射中,每个点注射量大约1x1010总滴度的病毒载体。  AAV感染脂肪

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化学遗传学技术

原文链接:和元生物——化学遗传学技术  化学遗传学技术(或称药理遗传学技术)是近年来与光遗传学一起出现的重要新技术。该技术通过对一些生物大分子实行改造,使其能和先前无法识别的小分子进行相互作用,从而达到可控、可逆(可以随时加入或除去化合物,从而启动或中断特定的反应)控制生物大分子的活性,该技术已经在信号转导、药物开发、功能基因组学等方面的研究中得到了广泛的应用。  他们被广泛用于以细胞特异性、无创地增强或抑制神经元的活动。虽然DREADD缺乏像光遗传学那样精准的时间控制能力,但是由于在进行疾病治疗时,最有可能需要的是长期神经元环路调节,而DREADDs会非常适合这类应用。此外,许多FDA批准药物的目标作用目标是GPCRs,而DREADDs是改造过的GPCRs,因此DREADDs可能会在药物开发方面提供丰富的可能性。  目前已改造的生物大分子包括核酸杂交、蛋白质激酶、各种代谢酶和G蛋白耦联受体(G protein‒coupledreceptors,GPCRs)。现在有很多基于GPCRs改造的化学遗传学平台,例如1991年构建的基因编码受体的等位基因特异激活(Allele-specific activation of genetically encoded receptors)、1998年构建的只能被合成配体激活的受体(Receptorsactivated solely by synthetic ligands, RASSLs)、基因工程改造的受体(Engineered receptors)和2007年构建的只由特定药物激活的受体(Designer receptors exclusively activatedby designer drugs,DREADDs)。其中,DREADDs已成为应用最广泛的化学遗传学技术,本文也将主要讨论DREADDs技术。    图1.化学遗传学技术  1)DREADDs技术  DREADDs技术是由Bryan L. Roth等人发明的,他们改变了G蛋白偶联受体—乙酰胆碱受体的结构,改变后其只能被特定的化合物Clozapine-N-oxide(CNO)激活或者抑制。此类改变的受体会选择性地作用于不同的GPCR级联反应,包括Gq、Gi、Gs、Golf和β-arrestin,其中应用最广泛的是Gq-DREADD和Gi-DREADD。通过将上述受体在细胞内表达,在CNO的作用下,其产生的结果各不相同。  图2 常用的几种DREADDs受体作用原理(Scott M. Sternson & Bryan L. Roth, Annu. Rev. Neurosci., 2014)  2)常见的DREADDs受体  1、Gq-DREADD和hM3Dq:  最初的Gq-DREADD即hM3Dq,改造自人毒蕈碱型乙酰胆碱受体(the human muscarinic acetylcholine receptor,mAchRs)亚型M3(也称为hM3)。在正常生理状况下,hM3和乙酰胆碱结合,然后和Gq类G蛋白耦合受体耦合,作用于磷脂酶C、肌醇三磷酸和胞内钙离子这一信号通路(图3)。  令人吃惊地是,只要将Y3.33C和A5.46这两个位点突变,就能使hM3受体不能和乙酰胆碱耦合,但是会和纳摩尔浓度级别的CNO结合,这种突变后的hM3受体被命名为hM3Dq (human M3 muscarinic DREADD receptor coupled to Gq)。由于Y3.33和A5.46在不同的人毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型中是保守的,M1和M5也已经被成功改造为Gq-DREADD(hM1Dq和hM5Dq)。但是到目前为止,hM3Dq仍然是应用最多的Gq-DREADD。  在不同的细胞类型中,CNO诱导hM3Dq的结果是不一样的,比如:1)  在成熟神经元中,CNO诱导hM3Dq的结果是将神经元去极化(depolarization),加强神经元的兴奋性,这也是hM3Dq最常用的功能,即促使神经元的放电活动;2)  在星形胶质细胞中,有人报道CNO诱导hM3Dq的结果是增加星形胶质细胞Ca+的释放,从而改变自主神经系统的生理条件;3)  在神经系统以外,也有一些研究,例如在胰腺Β细胞表达hM3Dq,急性CNO处理会促进胰岛素的释放,而慢性CNO处理导致Β细胞数目增加;在肝细胞中,激活hM3Dq会增加血糖水平,也许是因为糖原分解和糖异生作用增加。    图3. hM3和乙酰胆碱结合,作为信号分子激活Gq耦联的GPCRs信号通路  2、Gi-DREADD和hM4Di:  Y3.33和A5.46在不同的人毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型中是保守的,因此科学家同样可以突变M2和M4 mAchRs上的Y3.33、A5.46位点,由于M2、M4的下游激活的是Gi通道,于是产生Gi- DREADDs,命名为hM2Di和hM4Di,他们可以激活Gi调节的信号通路(图4)。  Gi耦合的GPCRs可以激活G蛋白内向整流钾通道(GIRK),在CNO的作用下, hM2Di和hM4Di受体被激活可以抑制神经元的放电活动,其中使用最多的Gi-DREADD是hM4Di。也有研究表明,hM4Di可以抑制神经递质的释放,从而达到抑制神经元活动的效果。    图4 hM4和乙酰胆碱结合,作为信号分子激活Gi耦联的GPCRs信号通路  更多化学遗传工具病毒请搜索。。。  3)DREADDs技术的应用策略  借助病毒载体的DREADDs技术应用一般包括以下几个关键步骤(图5):  1、 根据实验目的,确定合适的DREADDs受体,一般来说,激活神经元选择hM3Dq,抑制神经元选择hM4Di;  2、借助病毒载体在动物体内表达DREADDs受体;  3、设计实验方案,在合适的时间窗口内给予动物CNO药物,激活受体,给予CNO的方式包括脑内定位注射、腹腔注射和喂水;  4、表型检测,通过行为学或电生理手段等检测神经元活动变化带来的变化。    图5. DREADDs技术的一般策略  4)DREADDs技术优势  DREADDs技术和光遗传学技术应用起来非常接近,其目的也是同样的,那么,我们日常研究中如何对其进行选择?选择的标准就是两种技术的优缺点分析:  DREADDs技术的优势主要有:  1、实验要求较低,操作简单:不像光遗传学技术需要光纤、激光控制器等,DREADDs技术只需常规药理学技术手法,注射或者喂食CNO即可;  2、非侵入性:不像光遗传技术需进行开颅手术埋置光纤,因此不会因为额外负重影响小鼠行为,可实现在小鼠完全自由活动的情况下调控特定脑区和特定神经元的活动;  3、实现长时间激活或抑制神经元活动:由于两种技术原理不同,光遗传学技术依赖的是光敏感通道的开放,是需要离子在细胞膜上的流动产生电位变化,影响神经元活动,而长时间离子逆浓度差进出细胞需消耗大量ATP(如离子泵),这会导致细胞受损死亡,此外光刺激的热效应同样会损伤细胞。相比之下,DREADDs表达的是一种受体,可以长达数小时持续激活或抑制神经元活动而不影响细胞正常生理;  4、安全性高:CNO是FDA批准上市药物-氯氮平的代谢产物,体内应用相对安全。此外,许多FDA批准药物的目标作用目标是GPCRs,而DREADDs是改造过的GPCRs,因此DREADDs可能会在药物开发方面提供丰富的可能性。  表1 光遗传与化学遗传优缺点比较  光遗传学技术 DREADDs技术  时间上 时间精准度到毫秒级别甚至是亚毫秒级 小时级,可实现长达数小时持续激活或抑制神经元活动而不影响细胞正常生理  空间上 通过脑定位注射、特异性启动子、亚细胞器定位肽,将光敏感蛋白锚定在靶向细胞或细胞器进行操作,可达到单个细胞的级别 通过定位注射、特异性启动子将DREADDs受体锚定某类特定的细胞  操作技术 开颅手术埋置光纤,需要光纤、激光控制器等,操作相对有难度 非浸入性,只需常规药理学技术手法,注射或者喂食CNO即可  DREADDs技术应用案例  1、hM4Di  ① 客户发表文章:Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相关病毒, 痒, 光遗传,化学遗传]    注射部位:小鼠PBN  载体:AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine  血清型:AAV2/9  病毒滴度:1.0× 1013 VG/mL  注射体积:150nl  观察时间:3周  ② 客户发表文章:Neuron . (IF=14.319). Xu HF, et al. (2019) A Disinhibitory Microcircuit Mediates Conditioned Social Fear in the Prefrontal Cortex. [社交恐惧症, AAV,化学遗传]  注射部位:小鼠PrL  载体:AAV2/9-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry  血清型:AAV2/9  病毒滴度:3.44× 1013 VG/mL  注射体积:100-200nl  观察时间:4周

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稳定细胞株构建

原文链接:和元生物——稳定细胞株构建外源基因在细胞中的表达可分为两大类,一类是瞬时表达,外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,虽然可以达到高水平的表达,但通常只持续几天;一类是稳定表达(构建稳转株),外源DNA整合到宿主细胞染色体上,使宿主细胞可长期表达目的基因。建立稳定细胞株,基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上,载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中,用载体中所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)和嘌呤霉素(puromycin),筛选得到可稳定表达目的蛋白、或稳定沉默特定基因的细胞株。筛选方法慢病毒感染筛选稳定细胞株利用慢病毒整合表达特性来筛选稳定细胞株,该方法克服了传统质粒挑单克隆方法周期久的弊端,可以在短时间内高效获取稳定细胞株。利用慢病毒制备稳定株优势(1)细胞适用种类广泛,可用于各种哺乳动物细胞;(2)构建稳转株时间短,表达持续时间长;(3)多种荧光标记和抗性基因可选,满足观测实验要求。稳定细胞株分类  混合克隆稳定细胞株  混合克隆细胞系是基因转染后直接用抗药筛选得到的,筛选出的细胞都表达抗性基因和目的基因,但包含了各种不同的细胞克隆。不同克隆的目的基因整合位置和表达量均有所不同。  混合克隆细胞株筛选比较快速,费用较低。在需要构建的细胞株转染效率高,目的基因表达效率高的情况下,单克隆细胞株最后得到的表达效果和混合克隆细胞株并没有显著差异,这时多克隆细胞筛选是理想的选择。  单克隆稳定细胞株  单克隆细胞系是由含有稳定整合外源片段的单个细胞的扩增得到的细胞株,每个细胞的目的基因整合位置的表达量均高度一致,但可能丢失一些表型。单克隆细胞株筛选周期长,费用高。需要进行细胞亚定位实验的细胞系,难感染的和表达率低的通常建议进行单克隆细胞筛选。服务流程已构建的稳定株列表(部分)中文名称对应稳定株对应培养条件细胞来源人脑星形胶质母细胞瘤U-87 MG-luc-mNeonGreen-PuroMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院人胶质瘤细胞U251-CMV-EGFP-PuroDMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院人膀胱移行细胞癌细胞T24-EGFP-PuroRPMI-1640+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院人胰腺癌细胞系SW 1990-EGFP-PuroL-15+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH-EGFP-PuroMEM+10%FBS+0.4ug/ml Puromycin中科院人乳腺癌细胞SK-BR-3-EGFP-PuroDMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院人子宫颈鳞癌细胞SiHa-CMV-EGFP-PuroDMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2a-EGFP-PuroMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2a-CMV-PuroMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院人乳腺癌细胞MDA-MB-468-EGFP-PuroL-15+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院人乳腺癌细胞MDA-MB-231-CMV-EGFP-Luc-PuroL-15+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院人乳腺癌细胞MCF7-CMV-EGFP-PuroMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院小鼠肺癌细胞LLC-CMV-sfGFP-Luc-PuroDMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院人慢性髓原白血病细胞K-562-CMV-EGFP-PuroRPMI-1640+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat-CMV-EGFP-PuroRPMI-1640+10%FBS+0.5ug/ml Puromycin中科院人子宫内膜癌细胞ishikawa-CMV-PuroRPMI-1640+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院人肝癌细胞HuH-7-CMV-sfGFP-Luc-PuroDMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院人肝癌细胞HuH-7-Luc PuroDMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院人结肠癌细胞HT-29-EGFP-PuroMcCoy’s 5A+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院人肝癌细胞Hep G2-CMV-EGFP-Luc-PuroDMEM+10% FBS+2ug/ml Puromycin中科院人肝癌细胞Hep G2-CMV-PuroDMEM+10% FBS+2ug/ml Puromycin中科院人宫颈癌细胞HeLa-EGFP-PuroDMEM+10% FBS+2ug/ml Puromycin中科院人宫颈癌细胞HeLa-RFP-PuroDMEM+10% FBS+2ug/ml Puromycin中科院人结肠癌细胞HCT 116-CMV-EGFP-Luc-PuroMcCoy’s 5A+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院人咽鳞癌细胞FaDu-CMV-EGFP-PuroMEM+10%FBS+1ug/ml Puromycin中科院小鼠结肠癌细胞CT26.WT-CMV-Luc-PuroRPMI-1640+10%FBS+8ug/ml Puromycin中科院小鼠结肠癌细胞CT26.WT-CMV-PuroRPMI-1640+10%FBS+8ug/ml Puromycin中科院人肾透明细胞癌皮肤转移细胞Caki-1-EGFP-PuroDMEM+10% FBS+2ug/ml Puromycin中科院仓鼠肾成纤维细胞BHK-21 [C-13]-CMV-PuroMEM+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院人甲状腺乳头状癌细胞B-CPAP-CMV-EGFP-PuroRPMI-1640+10%FBS+1%NEAA+2ug/ml Puromycin中科院小鼠黑色素瘤细胞B16-CMV-PuroRPMI-1640+10%FBS+1ug/ml Puromycin中科院小鼠黑色素瘤细胞B16-CMV-EGFP-PuroRPMI-1640+10%FBS+1ug/ml Puromycin中科院人非小细胞肺癌细胞A549-CMV-EGFP-PuroF12K+10% FBS+2ug/ml Puromycin中科院人非小细胞肺癌细胞A549-luc-mNeonGreen-PuroF12K+10% FBS+2ug/ml Puromycin中科院小鼠乳腺癌细胞4T1-CMV-Luc-PuroRPMI-1640+10%FBS+1ug/ml Puromycin中科院小鼠乳腺癌细胞4T1-CMV-EGFP-PuroRPMI-1640+10%FBS+1ug/ml Puromycin中科院人胃癌细胞MKN-45-CBh-luc2-mNeonGreenA-PuroRPMI-1640+20%FBS+2ug/ml Puromycin协和人肺腺癌细胞NCI-H1975-CBh-luc2-mNeonGreenA-PuroRPMI-1640+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院人结肠癌细胞HCT116-CBh-luc2-mNeonGreenA-PuroMcCoy’s 5A+10%FBS+2ug/ml Puromycin中科院

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细胞功能学实验

原文链接:和元生物——细胞功能学实验细胞增殖       细胞增殖与细胞凋亡、细胞周期等是肿瘤研究的重要表型,是分子生物学和药理学研究解决的问题之一。通过在细胞中过表达或干扰某个基因研究基因对细胞增殖能力的影响,进一步研究基因的功能,或对细胞进行药物处理,研究药物对增殖的影响。实验原理(CCK-8)细胞增殖是生物体的重要生命特征,细胞以分裂的方式进行增殖,是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。细胞增殖的研究方法有很多,主要包括:CCK8/ CellTiter-Glo™等方法。Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为:该试剂中含有WST-8【化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】,它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8方法优势:   1 操作简单,避免细胞计数过程中人为因素的影响;   2 细胞用量少,检测灵敏度高,稳定;   3 可反复用酶标仪读板,检测时间灵活,不影响细胞进行后续实验;   4 CCK-8产生的Formazan是水溶性的,无需换液,尤其适用于悬浮细胞,与MTT法相比更方便,更安全。  目的:考察目的基因对细胞的增殖能力产生的影响或药物对细胞增殖能力的影响  材料:目的细胞、稳转株(空载、目的基因)  步骤:细胞收集——细胞铺板——(药物处理)——细胞培养0、6、24、48、72小时后加入CCK-8处理,酶标仪检测实验原理(CellTiter-Glo™)  ATP腺嘌呤核苷三磷酸(简称三磷酸腺苷)参与生物体内多种酶促反应,是活细胞新陈代谢的一个指标,其含量直接反应了细胞的数量及细胞状态:实验过程中向细胞培养基加入等体积CellTiter-Glo™试剂,测量发光值,在光信号和体系中,发光值与ATP量成正比,而ATP又和活细胞数正相关,因此可通过检测ATP含量得细胞活力。  CTG方法优势:  1 同普通的MTT、CCK8法相比,CellTiter-Glo™发光活细胞检测系统的检测试剂具有最高灵敏度和较长的信号持续时间,此系统已经广泛地应用在生命科学研究领域中,如一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等;  2 CellTiter-Glo™试剂和细胞培养中的常用培养基兼容,如RPMI1640、MEM、DMEM和 Ham's F12,也不受酚红和有机溶剂的影响,误差小,准确率高。  目的:考察目的基因对细胞的增殖能力产生的影响或药物对细胞增殖能力的影响  材料:目的细胞  步骤:细胞收集——细胞铺板——(药物处理)——细胞培养0、24、48、72、96小时后加入CellTiter-Glo™溶液用微孔板震荡器5分钟,于室温放置10分钟-酶标仪检测荧光值细胞凋亡  细胞凋亡是肿瘤和发育研究的重点,同时也是药理学研究的热点。细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自主结束其生命的过程。它是一个主动的,高度有序的,基因控制的,一系列酶参与的过程。细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段:接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化(Caspase)→进入连续反应过程。  基本原理  细胞凋亡检测采用Annexin V/PI双染法检测,Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)高亲和力特异性结合。在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。将Annexin V 进行荧光素(FITC或PE)或Biotin 标记,以标记了的Annexin V 作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。  7-AAD类似于碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,7-AAD能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin V 与7-AAD 匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。  目的: 通过慢病毒感染获得过表达某基因的细胞株,利用Annexin-PE和7-AAD双染法对正常细胞、对照组细胞、基因过表达组细胞的凋亡情况进行检测,研究基因对细胞凋亡的影响。  材料:质粒与细胞株  步骤:细胞准备——收集细胞——Annexin-PE和 7-AAD进行双染色——流式上机检测细胞侵袭和迁移  在肿瘤发展过程中,细胞进入循环系统的能力是重要的研究对象。相关的信号通路主要可以分为控制细胞黏附和控制细胞骨架。细胞的迁移与侵袭主要与细胞骨架和黏附相关。肿瘤细胞侵袭和迁移能力的改变通常采用Transwell进行检测。细胞划痕也是测定肿瘤细胞运动特性的方法,由于无法区别正常增殖和迁移细胞,应用有局限性。       Transwell实验  Transwell小室底层的一张有通透性的膜(一般为聚碳酸酯膜),将其放置于孔板中,小室内称上室,培养板内称下室。由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞。应用Transwell可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。  肿瘤迁移实验:研究肿瘤细胞的迁移能力或特定情况下肿瘤细胞的迁移能力。常用8.0、12.0µm膜,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。  肿瘤侵袭实验:研究肿瘤细胞的侵袭能力或特定情况下肿瘤细胞的侵袭能力。在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶,模仿细胞外基质,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,细胞要把基质消化后才可以从上室迁移到下室,计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。  目的: 研究目的基因过表达/干扰对细胞侵袭、转移能力的影响  材料:正常细胞、对照慢病毒、过表达基因慢病毒  步骤:细胞复苏——Transwell铺板——细胞培养及染色——拍照  划痕实验原理  肿瘤细胞在体外仍具有迁移的能力。细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型,在体外培养的单层细胞上,划痕致伤,然后比较不同实验组中肿瘤细胞迁移的能力。  目的: 使用筛选的稳定株(转对照病毒、过表达基因病毒),通过对空细胞、对照稳转、目的基因稳转三组细胞进行划痕宽度进行统计学分析,研究基因对细胞迁移能力的影响。  材料:病毒和细胞株,目的细胞来源于客户,稳定株和元构建  步骤:细胞铺板——划线——细胞培养及拍照——统计分析 细胞周期检测  细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程,分为间期与分裂期两个阶段。细胞周期反应了细胞增殖速度,单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法,但它不能代表细胞群体的周期,故现多采用其他方法测群体周期。  原理:  细胞周期各时相的DNA含量不同,通常正常细胞的 G0/G1期具有二倍体细胞的DNA 含量(2N),而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。PI 即碘化丙锭,可以与细胞内DNA 和RNA 结合,采用RNA酶将RNA消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI 的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。  因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为 G0/G1期,S 期和G2/M期,并可通过特殊软件计算各时相的百分率。  目的: 通过慢病毒感染获得基因过表达的细胞株,利用PI染色法结合流式细胞术检测各组细胞周期的变化。从而研究目的基因对细胞周期的影响。  材料:目的细胞、病毒  步骤:细胞准备——样品收集——上机检测——数据分析克隆形成实验  原理:单个细胞在体外增殖6代以上(时间约1周以上),其后代所形成的细胞群体,称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞,大小在0.3 - 1.0mm之间。细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数, 但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖并形成克隆。只有同时具有贴壁和增殖活力的细胞才会形成克隆。克隆形成率反映细胞的独立生存能力的强弱,用于评价细胞群体依赖性和增殖能力。由于细胞生物学性状不同,细胞克隆形成率差别也很大,一般初代培养细胞克隆形成率弱,传代细胞系强; 二倍体细胞克隆形成率弱,转化细胞系强;正常细胞克隆形成率弱,肿瘤细胞强。克隆形成率与接种密度有一定关系,做克隆形成率测定时,接种细胞一定要分散成单细胞悬液,直接接种在培养皿中,持续一周以上,随时检查,到细胞形成克隆时终止培养。  目的:通过目的基因过表达/干扰细胞组、空细胞组与阴性对照组(空病毒)克隆形成数量的统计学分析,研究基因对细胞群体依赖性和增殖能力的影响。  材料:病毒和细胞株  步骤:铺板——细胞培养——观察克隆,染色,计算克隆形成率

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萤光素酶报告基因检测

原文链接:和元生物——萤光素酶报告基因检测  萤光素酶是理想的报告基因,因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶,一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶。单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响,而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线,从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响,使得数据结果更为可信。Dual-Luciferase®双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶,两者没有种源同源性并对应不同的反应底物,故而没有交叉干扰。得益于超强的光信号和超高的信噪比。   miRNA靶基因验证  miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用(降解或抑制翻译),将目的基因3’UTR(野生型和结合位点突变型)序列构建至载体中报告基因F-Luc的3’端,通过比较过表达miRNA后,报告基因表达的改变(萤光素酶的活性下降还是不变),来确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。  目的:验证 miRNA与靶基因3’UTR 是否发生调控作用。  材料:质粒pMIR-REPORT Luciferase基因3'UTR(Wt);pMIR-REPORT Luciferase-基因3'UTR(Mut);pRL-CMV(H321,Promega);293T细胞株  步骤:靶点预测——构建质粒——转染细胞检测——报告基因检测(Luciferase活性检测)——统计分析  结果展示:   启动子活性研究  转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合,这些特异性的序列被称为顺式因子,转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用。  转录因子主要通过作用于靶基因的启动子起作用,将目的基因启动子区序列替换报告基因F-Luc的启动子,通过共表达转录因子后,报告基因表达的改变,来确定转录因子与靶基因启动子结合位点及对靶基因的作用。  目的:检测转录因子对目的基因启动子活性的影响  材料:实验质粒(pGL4.10-基因promotor);对照质粒; pRL-CMV(E2261,Promega);转录因子质粒;293T细胞株  步骤:靶点预测——构建质粒——转染细胞检测——报告基因检测(Luciferase活性检测)——统计分析  结果展示:  客户需提供信息:  1 靶基因名称  2 靶基因种属  3 调控因子(miRNA或者转录因子)名称  提供给客户:  1 结合位点预测结果  2 质粒及其构建报告  3 双荧光素酶检测报告

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细胞株现货

原文链接:和元生物——细胞株现货  和元生物拥有丰富的细胞现货库,以肿瘤细胞株为主要特色的细胞库,涵盖几百种现货肿瘤细胞株。同时还有已经构建过表达荧光、抗性或携带Luc的稳定细胞株客供选择, 细胞库管理专业、规范,技术团队是专业从事细胞培养、保种、鉴定和检测的团队。  细胞株现货列表如下(部分):货号细胞名称种属培养基中文名称HYC3001293T/17人DMEM+10%FBS人胚肾细胞HYC3099FaDu人MEM+10%FBS人咽鳞癌细胞HYC3111Hep 3B2.1-7人MEM+10%FBS人肝癌细胞HYC3112Hep G2人MEM+10% FBS人肝癌细胞HYC3117HuH-7人DMEM+10%FBS人肝癌细胞HYC3129AsPC-1人RPMI-1640+10%FBS人转移胰腺腺癌细胞HYC3131HCT 116人MycCoy’s 5A+10%FBS人结肠癌细胞HYC3132HT-29人McCoy’s 5A+10%FBS人结肠癌细胞HYC3139LS 174T人DMEM+10%FBS人结肠腺癌细胞HYC3141HCT-15人RPMI-1640+10%FBS人结直肠腺癌细胞HYC3154786-O [786-0]人RPMI-1640+10%FBS人肾透明细胞腺癌细胞HYC3161SV-HUC-1人F12K+10%FBS人输尿管上皮永生化细胞HYC3164HuT 78人IMDM+20%FBS人T淋巴细胞白血病细胞HYC3165COLO 320DM人RPMI-1640+10%FBS人结直肠腺癌细胞HYC3172UM-UC-3人MEM+10%FBS人膀胱移行细胞癌HYC3187MDA-MB-436人L-15+10%FBS人乳腺腺癌细胞HYC3189SiHa人MEM+10%FBS人子宫颈鳞癌细胞HYC3198ES-2人McCOY’s 5A+10%FBS人卵巢透明细胞癌HYC3205MDA-MB-231人L-15+10%FBS人乳腺癌细胞HYC3211BT-549人RPMI-1640+10%FBS或DMEM+20%FBS人乳腺管癌细胞HYC3217A549人F12K+10% FBS人非小细胞肺癌细胞HYC3221NCI-H292人RPMI-1640+10%FBS人肺癌细胞(淋巴结转移)HYC3222MSTO-211H人RPMI-1640+10%FBS人肺癌细胞株HYC3223SK-MES-1人MEM+10%FBS人肺鳞癌细胞HYC3225NCI-H1395人RPMI-1640+10%FBS人肺腺癌细胞HYC3228NCI-H1975人RPMI-1640+10%FBS人肺腺癌细胞HYC3235MG-63人MEM+10%FBS人骨肉瘤细胞HYC3236SW 1353人L-15+10%FBS人软骨肉瘤细胞HYC3238MNNG/HOS Cl #5 [R-1059-D]人MEM+10%FBS人骨肉瘤细胞HYC3241U-87 MG人MEM+10%FBS人脑星形胶质母细胞瘤HYC3244SK-N-SH人MEM+10%FBS人神经母细胞瘤细胞HYC3246U251人DMEM+10%FBS人胶质瘤细胞HYC3249CCRF-CEM人RPMI-1640+10%FBS人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞HYC3254Raji人RPMI-1640+10%FBS人Burkitt’s淋巴瘤细胞HYC3256Jurkat, Clone E6-1人RPMI-1640+10%FBS人T淋巴细胞白血病细胞HYC32576T-CEM人RPMI-1640+10%FBS人T细胞白血病细胞HYC3259K-562人IMDM+10%FBS人慢性髓原白血病细胞HYC3262Reh人RPMI-1640+10%FBS人急性非B非T淋巴细胞白血病

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动物实验

原文链接:和元生物——动物实验和元生物动物实验部成立于2014年,拥有国内先进的小动物SPF级动物房,设有实验动物管理委员会(IACUC),具有上海科委颁发的SPF级大、小鼠的《实验动物使用许可证》SYXK(沪)2017-0003。SPF区域使用面积为350m2,可同时容纳饲养大、小鼠5000余只,为客户同时提供约50-100批动物实验项目服务。动物房屏障内全部设有独立通气式动物IVC及自动压差调节系统,温湿度实时监控系统,人、动物、物品分离并单向流动路线,严格保障屏障内环境。和元生物动物实验部所有实验操作人员均接受过严格的培训管理,具备相应岗位资格证书。同时,动物房还配备专业的管理人员,严格保障屏障内环境的洁净度和动物的质量控制。目前,和元生物可提供大小鼠饲养繁育鉴定、动物模型构建(包括肿瘤、神经系统、代谢疾病模型)、药理药效学评价、行为学及病理检测一站式服务,为各种疾病的机制研究和新药的开发提供良好的科研平台。大小鼠扩繁服务:和元生物动物实验部可提供大小鼠饲养繁育鉴定服务。根据客户需求,提供最为专业的交配饲养方案,提高繁殖效率、节省饲养成本。优势:· 舒适、洁净的饲养环境· 严格的质量控制管理体系· 高度重视动物福利,高品质SPF级大小鼠饲养· 短时间一次性获得大量相同基因型子代小鼠

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肿瘤动物模型

原文链接:和元生物——肿瘤动物模型肿瘤动物模型在肿瘤发生、发展、转移等基础研究以及药物研发治疗上扮演着至关重要角色,因此肿瘤的研究离不开动物模型的建立。科研中常用的肿瘤模型有以下几种:皮下成瘤、原位成瘤、尾静脉注射模型皮下成瘤模型将肿瘤细胞(或肿瘤组织)直接接种在小鼠的皮下而建立的一种肿瘤动物模型。该肿瘤模型是一种用于临床前评估药物体内药效的简单而重要的工具,同时,在肿瘤的发病机制、药物作用的研究中亦起到重要作用。皮下成瘤该模型操作简单方便,可以直观观察肿瘤的生长,方便检测动物体重、肿瘤生长曲线、肿瘤重量等重要数据;原位移植模型原位移植指将肿瘤细胞或肿瘤组织块原位移植到免疫缺陷动物的组织器官内,使之产生肿瘤并形成自发性转移灶。其方法是将稀释好的肿瘤细胞直接接种到器官的浆膜下。或者先将肿瘤细胞皮下接种,达500-800mm3左右,瘤组织取出切成1-3mm3的小块,将准备好的癌组织块植入器官的浆膜下,缝合浆膜,这样也可以形成异种原位肿瘤。常用原位接种包括:脑、肝、肌肉、乳腺垫原位。                                  原位移植模型能更好的模拟肿瘤细胞在体内生长的微环境,模拟肿瘤生长甚至转移的过程。尾静脉注射肿瘤转移模型肿瘤细胞经尾静脉注射后,先通过肺部的毛细血管网进入动脉血液循环系统,可造成全身多发转移灶。但是由于肿瘤细胞较为粘稠易聚团,一般会被困在小鼠肺部微血管,主要形成肺转移,可能后期会造成远端器官的转移。主要用于建立肿瘤转移(血行通路)模型或血癌模型或者肿瘤肺转移。尾静脉注射乳腺癌细胞肿瘤转移是临床上肿瘤致死的最主要原因,然而肿瘤转移的机制和过程非常复杂,目前尚不完全清楚。建立转移模型,可以更好地模拟肿瘤在人身上的发生和发展过程,对药物筛选和开发的预测性更高。和元上海动物实验平台可提供皮下成瘤、原位成瘤、尾静脉注射转移成瘤等多种肿瘤动物模型构建及病理切片、药效检测、小动物成像等服务。

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代谢类疾病动物模型

原文链接:和元生物——代谢类疾病动物模型和元生物动物实验部可提供大小鼠肥胖、糖尿病、心血管系统疾病及炎症等多种代谢及循环系统疾病动物模型的构建服务。1、肝损伤模型肝脏疾病是发生在肝脏的所有疾病的总称。包括感染性疾病、肿瘤性疾病、血管性疾病、代谢性疾病、中毒性疾病、自身免疫性疾病、遗传性疾病、肝内胆管结石病等。感染性疾病又包括病毒感染、细菌感染、寄生虫感染等,如病毒性肝炎、肝包虫病等。肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤,如肝癌、肝血管瘤、肝脂肪瘤、肝肉瘤等。肝脏疾病动物模型的运用范围非常广。四氯化碳诱导的肝损伤模型:通过腹腔注射不同剂量的四氯化碳(CCl4)致小鼠急性肝损伤,检测小鼠血浆转氨酶水平的变化,建立的小鼠模型。胆汁淤积型小鼠肝损伤模型:通过胆管结扎诱导胆汁淤积型小鼠肝损伤模型。2、肾缺血再灌注损伤模型的建立慢性肾功能衰竭(CRF)模型:大鼠5/6肾切除后残余存肾单位的血液动力学改变,引起残余肾单位的高滤过蛋白尿,导致以肾小球硬化为主要特点的CRF。急性肾损伤(AKI)模型:AKI是涉及多学科的临床常见危重病,患病率在综合性医院为3%~10%,在重症监护室为30%~60%,其重症患者死亡率高达 30%~80%,存活患者约50%遗留永久性肾损伤,防治形势严峻。 建立稳定的AKI动物模型,是早期发现和早期防治等肾病研究的关键。3、结肠炎模型肠胃病的种类很多,包括:溃疡性结肠炎、慢性肠炎、胃出血和胃穿孔等,其中溃疡性结肠炎是当今的研究热点。构建稳定的溃疡性结肠炎动物模型,有利于研究和阐述目前病因不明确的溃疡性结肠炎发病机制和治疗药物开发。DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎模型:造模七天后,小鼠结肠缩短、肠壁增厚、肠黏膜充血、局部出血、可见明显溃疡面,病变以盲肠和远段结肠为显著。HE染色结果,DSS组黏膜缺失,腺体多数不完整,炎症细胞广泛浸润,呈典型炎症改变。体重变化:2.5% DSS诱导的小鼠体重出现下降,小鼠食欲下降,活动欠佳。4、关节炎模型通过完全弗氏佐剂诱导关节炎大、小鼠模型。关节炎(arthritis)泛指发生在人体关节及其周围组织,由炎症、感染、退化、创伤或其他因素引起的炎性疾病,可分为数十种。化合药物诱导型关节炎动物模型,造模方法具有简便易行,对动物影响小、操作简便省时等优点。造模成功后动物关节肿胀明显,其表现接近于人类关节炎症状,且造模过程简单,稳定,临床病理与免疫学改变类似于人类关节炎,是较为理想的关节炎动物模型。5、心血管疾病模型冠状动脉结扎致大、小鼠心肌缺血模型,包括急性心肌梗死、慢性心肌梗死、慢性心力衰竭及心肌缺血再灌注等药效试验服务项目,主要包括造模、药效试验、药效评价等。

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外泌体

原文链接:和元生物——外泌体外泌体(Exosomes)是细胞分泌到胞外的一种囊泡(Extracellular Vesicles,EVs),其大小为30-150nm,具有双层膜结构和茶托状形态,含有丰富的内含物(包括核酸、蛋白和脂质等),参与细胞间的分子传递。外泌体广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中,包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等,同时也存在于组织样本中,如脑组织、肌肉组织、脂肪组织等。脑组织分离方法简述:将脑组织剪成薄片,放入离心管中加上消化液进行消化,经水浴、反复轻轻上下颠倒,再用移液枪间断缓慢吹吸至消化结束。随后加入培养基于消化液中,混匀,置于冰上。再进行一系列的差速超速离心过程,包括除杂、滤膜过滤、超离等。最后用PBS重悬外泌体,用重悬后的外泌体进行下面的透射电镜(TEM)、纳米粒径跟踪分子(NTA)和marker WB鉴定。图一 胞外囊泡分泌所有的细胞都能分泌外泌体,但是不同细胞分泌的外泌体不管在数量上还是在内含物中都具有很大的差异性,这也决定了每种外泌体所行使的功能不一样。外泌体广泛参与细胞间物质运输与信息传递,调控细胞生理活动。同时,外泌体具有抗原提呈、免疫逃逸、诱导正常细胞转化、促进肿瘤发生和转移等作用;此外,外泌体还可以作为“天然的纳米粒子”来进行药物递送。外泌体相关数据库有哪些?l exoRBase数据库收集和描述人类血液外泌体中所有长的RNA,包括circRNA、lncRNA和mRNA。l EVpedia和Vesiclepedia数据库汇总了不同囊泡研究中发现的蛋白、mRNA、miRNA、脂类等信息。l ExoCarta数据库主要收录了包括人、大鼠、小鼠、绵羊等几个物种的286个研究结果,涉及蛋白、mRNA、miRNA、脂类等信息。样本预处理与外泌体分离、保存:外泌体存在于人类或动物的各种体液中,我们可以选择不同的样本来源进行相关的外泌体研究。由于外泌体是来源于细胞质膜内陷的含有脂质双分子层膜结构的多泡小体,分布于胞外基质。为了获得高纯度的外泌体,必须确保有效去除所有的细胞碎片及其他不需要的杂质。1) 细胞培养上清                  2)血浆/血清3)尿液                           4)脑脊液5)卵泡液                         6)宫腔液7)胆汁                           8)羊水9)腹水                           10)胸腔液不同的实验样本采集时需要注意的地方不一样,如细胞培养上清在收集样本前需换成无外泌体血清培养、血浆样本采集时用一定不能用肝素抗凝管、尿液收集时需要加抑菌剂等。从生物体液中分离外泌体的各种方法已经被开发出来,主要根据外泌体的大小、密度、免疫特性等特点进行操作。分离出高纯度的外泌体是我们后续开展外泌体研究的关键步骤,目前差速超速离心是外泌体分离方法中公认的“金标准”,也是高分文章中首选的分离方法。 外泌体提取在短时间(一周之内)使用,可以放在4度保存,如果长时间保存可以放在-20度或-80度保存。也可以将外泌体进行分装,分别放在-20度或-80度。外泌体检测方法:外泌体分离之后,需要经过一系列鉴定才能确定分离的是外泌体。鉴定方法从物理特征到表面分子标志物,多角度进行鉴定。l 透射电镜鉴定法:简称TEM,适合外泌体双层囊膜超微结构观察,即通常为茶托型或一侧凹陷的半球形。图二 透射电镜l 纳米颗粒跟踪分析法:简称NTA,该方法能保证外泌体原始状态、检测速度快,检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。 图三 NTAl Western blot分子标志物检测:外泌体标志蛋白包括四跨膜蛋白家族,如CD9、CD63和CD81;细胞质蛋白,如肌动蛋白(Actin)和钙磷脂结合蛋白(Annexins);参与生物功能的分子,如凋亡转接基因2互作蛋白X(ALIX)、肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、热休克蛋白(HSP70、HSP90),以及细胞分泌的特异性蛋白。 图四 Western Blot(Tian Su et al., ACS Nano. 2019)外泌体高通量检测外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质和核酸,可以运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等进入受体细胞,参与细胞间通讯。不同细胞来源的外泌体所含有的蛋白成分和RNA不太相同,可作为多种疾病的早期诊断标记物,也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。1. miRNA高通量测序2. mRNA高通量测序3. lncRNA芯片(人、小鼠)4. ceRNA芯片(人、小鼠)5. 蛋白质组分析(iTRAQ、TMT、Label-free)外泌体标记或示踪:l 亲脂染料标记外泌体:目前已发表的外泌体文章中,外泌体大多使用亲脂性染料进行标记,体内和体外都有较多应用。亲脂性染料主要分为两大类,第一类是PKH67(绿色荧光)/PKH26(红色荧光),由于它们可以与外泌体的脂质双层膜稳定结合,所以染色效果较好,应用较广泛。 图五 PKH67标记的外泌体与神经元之间相互作用(Juan Carlos Polanco et al., Acta Neuropathol Commun. 2018) 图六 PKH26标记的外泌体与MDA‐MB‐231细胞共培养(Mengyu Yu et al., Cancer Sci. 2019)第二类是Di系列的亲脂性染料,包括DiI(橙色荧光)、DiO(绿色荧光)、DiD(红色荧光)、DiR(深红色荧光)。其中DiR的红外荧光可穿透细胞和组织,在活体成像中用来示踪。 图七 DiI标记的外泌体通过静脉注射观察在体内器官的分布情况(Laura Otero-Ortega et al., J Cereb Blood Flow Metab. 2018)l 慢病毒介导CD63-GFP表达:将外泌体的特定蛋白CD63和绿色荧光蛋白GFP的表达元件构建成质粒再包装到慢病毒中,随后用此慢病毒感染细胞,使细胞分泌的外泌体带有绿色荧光。 图八 用GFP标记的外泌体分别与SH-SY5Y、BV2和DRG细胞共培养(Rui Ren et al., Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019) 图九 注射有CD63-GFP的外泌体后观察第1天(D1)和第5天(D2)的荧光(Rui Ren et al., Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019)外泌体功能研究:将标记的外泌体加入受体细胞培养基中,与受体细胞进行共培养,观察细胞的功能变化,如细胞增殖、迁移与侵袭、细胞凋亡等;或者将外泌体注射入动物模型中,观察动物表型变化和检测动物相关指标。 图十 DiR标记的外泌体静脉注射小鼠结肠癌肿瘤模型(Gaofeng Liang et al., J Nanobiotechnology. 2020)  图十一 外泌体的功能研究(Tian Fang et al., Nat Commun. 2018)我们的优势:1) 实验周期短;2) 价格优惠;3) 完善的售后服务;4) 项目经验丰富,成功率几乎100%;5) 完整的一套实验服务。我们提供的服务:1) 差速超速离心分离;2) 透射电镜拍摄(TEM);3) 纳米粒径跟踪分析(NTA);4) Western Blot检测蛋白标志物;5) 外泌体高通量测序/芯片;6) 外泌体标记或示踪;7) 外泌体细胞功能检测;8) 外泌体动物注射;9) 外泌体动物模型验证等。

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非编码RNA

原文链接:和元生物——非编码RNA  非编码RNA(Non-coding RNA)是指不编码蛋白质的RNA,包括miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA等。非编码RNA发挥功能的方式很多,可以与蛋白、DNA和RNA相互作用,参与多种细胞活动,主要包括基因的激活和沉默,RNA的剪接、修饰和编辑,蛋白质的翻译等。  1.miRNA:miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,它们在动植物中参与转录后基因表达调控。每个miRNA可以有多个靶基因,而几个miRNA也可以调节同一个基因。图一 miRNA成熟及作用方式(Mikhailidis DP, Athyros VG. Nat Rev Cardiol. 2014 Feb;11(2):72-4.)   miRNA过表达:将miRNA前体序列构建入病毒载体中,该载体既可用于瞬时转染细胞,也可以包装成病毒用于稳定株筛选和动物水平过表达miRNA。  miRNA敲低:设计针对miRNA的TuD RNA封闭片段或海绵片段,再将该片段构建入病毒载体中。该载体除了可以直接瞬时转染细胞用于miRNA的敲低,也可以包装成慢病毒,用于动物水平敲低miRNA。  miRNA靶基因预测:miRNA通过碱基互补配对的方式识别靶基因的3’UTR区,并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。因此,可以将目的基因的3’UTR区域构建到含luciferase的报告基因上,通过比较miRNA过表达或inhibitor 与报告基因作用检测荧光值的变化,判断miRNA对靶基因的作用。再通过对3’UTR区进行定点突变的方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。  miRNA常用数据库:   (1)miRbase(http://www.mirbase.org):miRbase 是由曼彻斯特大学的研究人员开发的一个在线的miRNA数据库,提供包括已发表的miRNA序列数据、注释、预测基因靶标等信息的全方位数据库,是存储miRNA信息最主要的公共数据库之一。  (2)TargetScan(http://www.targetscan.org/):TargetScan是通过搜索和每条miRNA种子区域匹配的保守的8mer和7mer位点来预测靶基因。  (3)TarBase(http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=tarbasev8%2Findex):TarBase数据库人工经历了长达10年左右的时间去搜集了实验验证过的miRNA的靶基因,包括在人、小鼠、果蝇、蠕虫和斑马鱼中的miRNA的靶基因。  (4)miRWalk(http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/):miRWalkis是一个综合性数据库,提供来自人类、小鼠和大鼠的miRNA的预测信息和经过验证的位于其靶基因上的结位点。  2.lncRNA:lncRNA是长链非编码RNA(long non-coding RNA)的简称,是长度在200-100000 nt之间的RNA分子。大多数的lncRNAs在组织分化发育过程中,都具有明显的时空表达特异性;序列上保守性较低,只有约12%的lncRNA可在人类之外的其它生物中找到。  根据lncRNA在基因组上相对于蛋白编码基因的位置,可以将其分为启动子区(promoter associated)、内含子间(intronic)、双向(bidirectional)、正义链(sense)、反义链(antisense)、3’UTR区(3’UTR associated)、基因间(intergenic)这7种类型。这种位置关系对于推测lncRNA的功能有很大帮助。  图二 lncRNA分类(Huang X, et al.Cancer Lett. 2018 Jan 28;413:94-101.)一般来说,lncRNA主要从以下三种层面实现对基因表达的调控:  (1)表观遗传学调控:lncRNA招募染色质重构复合体到特定位点进而介导相关基因的表达沉默。  (2)转录调控:包括如下几种:1)lncRNA的转录能够干扰临近基因的表达;2)lncRNA能够通过封阻启动子区域来干扰基因的表达;3)lncRNA能够与RNA结合蛋白作用,并将其定位到基因启动子区从而调控基因的表达;4)lncRNA能够调节转录因子的活性;5)lncRNA也能够通过调节基本转录因子来实现调控基因的表达。  (3)转录后调控:lncRNA能够在转录后水平通过与mRNA形成双链的形式调控基因的表达。  lncRNA过表达:将lncRNA序列构建入病毒载体中,该载体既可用于瞬时转染细胞,也可以包装成病毒用于稳定株筛选和动物水平过表达lncRNA。  lncRNA干扰:针对lncRNA设计干扰片段,再将该片段构建入病毒载体中。该载体除了可以直接瞬时转染细胞用于lncRNA的干扰,也可以包装成慢病毒,用于动物水平干扰lncRNA。  lncRNA敲除:用CRISPR/Cas9技术对lncRNA进行敲除。针对lncRNA某条片段的两端分别设计多条sgRNA序列,实现大片段删除,从而达到敲除的效果。将sgRNA序列构建入病毒载体中,再将Cas9序列装入另一载体中,随后两种病毒同时感染目的细胞进行敲除。  lncRNA靶基因寻找:方法基本类似于上面表述的miRNA双荧光素酶检测。  3.circRNA: circRNA即环形RNA(circular RNA)的简称,是一类不具有5’末端帽子和3’ 末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的客观存在于生物体内的非编码RNA分子。  circRNA主要特征:  (1)circRNA由特殊可变剪切产生,大量存在与真核细胞的细胞质中,主要来源于外显子,少部分内含子来源的circRNA存在细胞核中。  (2)表达水平具有种属、组织、时间特异性。  (3)circRNA呈闭合环状结构,不易被核酸外切酶降解,比线性RNA更加稳定。  (4)具有一定序列保守性。  (5)在转录或转录后水平发挥调控作用。  (6)绝大多数circRNA是非编码的,但也有少数可以翻译为多肽。  circRNA根据其来源可分为三类:外显子来源的circRNA(exonic circRNAs),内含子来源的circRNA(circular intronic RNAs,ciRNAs),以及由外显子和内含子共同组成的circRNA(retained-intron circRNAs)。  circRNA的作用机制:  miRNA分子海绵,circRNA含有大量的miRNA结合位点,具有miRNA海绵作用,进而间接调控miRNA下游靶基因的表达。  调控基因转录,circRNA也可以通过与RNA结合蛋白的结合来调控蛋白功能,比如通过与转录因子的结合来抑制基因的转录。  编码功能,circRNA虽然属于非编码RNA,但是也有少数circRNA可以编码多肽,通过该多肽行使调控功能。  circRNA过表达:同上述的lncRNA步骤类似,但是circRNA过表达由于成环效率的影响,其难度相对普通基因的过表达更大。  circRNA干扰:同上述的lncRNA方法步骤。  circRNA敲除:同上述的lncRNA方法步骤。  circRNA靶基因寻找:同上述的miRNA和lncRNA双荧光素酶检测方法。  我们的优势:  1)项目经验丰富,成功率高;  2)价格优惠,享受折扣;  3)实验周期短;  4)完善的售后服务。  我们可以提供的服务:服务内容服务形式一服务形式二miRNA过表达质粒构建慢病毒/腺相关病毒/腺病毒miRNA干扰质粒构建慢病毒/腺相关病毒/腺病毒lncRNA过表达质粒构建慢病毒/腺相关病毒/腺病毒lncRNA干扰质粒构建慢病毒/腺相关病毒/腺病毒lncRNA敲除质粒构建慢病毒/腺相关病毒/腺病毒circRNA过表达质粒构建慢病毒/腺相关病毒/腺病毒circRNA干扰质粒构建慢病毒/腺相关病毒/腺病毒circRNA敲除质粒构建慢病毒/腺相关病毒/腺病毒双荧光素酶实验质粒构建整套外包服务

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